[發明專利]小鼠NRDP1基因定點修飾系統及其應用

在審

• 申請號: 201610005851.4
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105567659A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 聶紅明;汪蓉;王學斌;陳建杰;高月求;梅昭荷;申弘
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬曙光醫院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

1.小鼠NRDP1基因定點修飾系統，其特征在于，所述基因定點修飾系 統為剪切小鼠NRDP1基因靶序列的轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs；

所述小鼠NRDP1基因靶序列如SEQIDNO.1所示，所述SEQIDNO.1 序列中：20～40位核苷酸為識別模塊TALNRD-2F、與57～74位核苷酸的互 補序列為識別模塊TALNRD-2R、40～56核苷酸為間隔序列；

所述轉錄激活樣效應因子核酸酶TALENs由識別所述識別模塊 TALNRD-2F的核酸酶TALEN-L和識別所述識別模塊TALNRD-2R的核酸 酶TALEN-R組成；所述核酸酶TALEN-L為SEQIDNO.2所示核苷酸序列 編碼的蛋白質，所述核酸酶TALEN-R為SEQIDNO.3所示核苷酸序列編碼 的蛋白質。

2.根據權利要求1所述的小鼠NRDP1基因定點修飾系統，其特征在于， 所述核酸酶TALEN-L由所述識別模塊TALNRD-2F的識別結構域TALEN-L 與經過人工改造的DNA切割蛋白Fok-I融合而成；所述核酸酶TALEN-R由 所述識別模塊TALNRD-2R的識別結構域TALEN-R與經過人工改造的DNA 切割蛋白Fok-I融合而成。

3.權利要求1所述小鼠NRDP1基因定點修飾系統在哺乳動物細胞或胚 胎NRDP1基因修飾中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述應用為建立NRDP1 基因敲除小鼠模型。

5.一種NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括下述 步驟：

(1)根據如SEQIDNO.1所示的小鼠NRDP1基因靶序列，構建具有 SEQIDNO.2所示核苷酸序列的pTALEN-L質粒和SEQIDNO.3所示核 苷酸序列的pTALEN-R質粒；

(2)通過體外轉錄獲得以所述pTALNRD-L質粒和pTALNDR-R質粒 為模板的mRNA混合物，顯微注射至小鼠胚胎的卵周隙中；

(3)將步驟(2)得到的小鼠胚胎移植到受體小鼠子宮，產仔獲得NRDP1 基因修飾的小鼠；

(4)使步驟(3)得到的NRDP1基因修飾的小鼠與野生型小鼠交配， 得到的仔鼠經過PCR和Western-Blotting測得到敲除雜合子個體，雜合子間 交配得到純合子小鼠，即完成NRDP1基因敲除小鼠模型的建立。

6.根據權利要求5所述的NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，其特 征在于，還包括對步驟(1)中得到的pTALNRD-L質粒和pTALNDR-R質 粒進行活性檢測的步驟，選擇對小鼠NRDP1基因具有修飾活性的 pTALNRD-L質粒和pTALNDR-R質粒為模板進行所述步驟(2)中的體外 轉錄。

7.根據權利要求6所述的NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，其特 征在于，所述對步驟(1)中得到的pTALNRD-L質粒和pTALNDR-R質粒 進行活性檢測的步驟為：將所述pTALEN-L質粒和pTALEN-R質粒共轉 染至小鼠細胞中，PCR擴增目的基因，通過測序鑒定目的基因是否發生突變。

8.根據權利要求5所述的NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，其特 征在于，步驟(4)之后還包括對所述NRDP1基因敲除小鼠模型進行鑒定分 析的步驟。

9.根據權利要求8所述的NRDP1基因敲除小鼠模型的建立方法，其特 征在于，所述對NRDP1基因敲除小鼠模型進行鑒定分析的步驟為：

(1)對NRDP1靶位點進行DNA測序，鑒定小鼠動物模型的基因型；

(2)通過Western-Blotting檢測小鼠各組織器官NRDP1蛋白的缺失；

(3)利用Western-Blotting監測因為NRDP1蛋白缺失而引起各個信號 通路蛋白表達的改變；

(4)觀察小鼠各組織器官或組織是否因為NRDP1蛋白缺失而發生病 變。

10.含有權利要求1所述的小鼠NRDP1基因定點修飾系統編碼基因的 重組表達載體、重組菌或重組細胞系。