[發(fā)明專利]高效誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體產(chǎn)生叢生芽的方法及培養(yǎng)基

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610005839.3
• 申請(qǐng)日: 2016-01-06
• 公開（公告）號(hào): CN105638468B
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄭志民
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽善達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/04
• 分類號(hào): C12N5/04;A01H4/00
• 代理公司: 沈陽維特專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)21229
• 代理人: 霍光旭

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)及誘導(dǎo)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體產(chǎn)生叢生芽的方法及培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

大豆原產(chǎn)我國(guó)，是目前世界上重要的油料作物及經(jīng)濟(jì)作物，并且是植物蛋白的重要來源。常規(guī)育種生產(chǎn)的大豆已不能滿足社會(huì)需求，需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因遺傳育種來生產(chǎn)高產(chǎn)具抗逆作用的大豆新品種。但大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)一直屬于植物基因工程領(lǐng)域的難點(diǎn)，受到多方面因素的限制，其中最主要的限制因素是大豆轉(zhuǎn)化子葉節(jié)外植體的適當(dāng)處理及之后叢生芽的快速大量誘導(dǎo)。如何提高大豆轉(zhuǎn)化子葉節(jié)外植體的誘發(fā)速度并在短期內(nèi)高效獲取大量?jī)?yōu)良的叢生芽是技術(shù)瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種高效誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體產(chǎn)生叢生芽的方法及培養(yǎng)基，解決了現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體時(shí)間長(zhǎng)、出芽率低的問題，填補(bǔ)了技術(shù)空白，將該方法應(yīng)用于相關(guān)的遺傳轉(zhuǎn)化研究和生產(chǎn)工作中，為轉(zhuǎn)基因研究提供了重要的技術(shù)平臺(tái)和支持。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種高效誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體產(chǎn)生叢生芽的培養(yǎng)基，包括MSB基本培養(yǎng)基，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)0.5～1.5g/L，蔗糖20～30g/L，谷氨酰胺40～60mg/L，天冬酰胺40～60mg/L，6-芐氨基嘌呤0.5～2mg/L，瓊脂6～8g/L，pH值為5.6～5.8。

進(jìn)一步地，培養(yǎng)基包括MSB基本培養(yǎng)基，2-(N-嗎啡啉)乙磺酸1g/L，蔗糖25g/L，谷氨酰胺50mg/L，天冬酰胺50mg/L，6-芐氨基嘌呤1mg/L，瓊脂6.5g/L，pH值為5.8。

根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了高效誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)外植體產(chǎn)生叢生芽的方法，包括如下步驟：

1)按照上述配方配置培養(yǎng)基；

2)大豆種子消毒滅菌及萌發(fā)，將大豆種子先用乙醇消毒5-10分鐘，再用過氧化氫消毒15-30分鐘，最后用滅菌水清洗3-5遍，之后再在大豆種子中加入滅菌水，放入4℃下靜置培養(yǎng)至長(zhǎng)出5-8mm胚軸；

3)大豆子葉節(jié)外植體的制備，將步驟2)中長(zhǎng)出5-8mm胚軸的大豆種子剝?nèi)シN皮，切去部分胚軸，留下帶有3-5mm上胚軸的大豆種子，沿胚軸中線縱向切開上胚軸，得到帶有3-5mm上胚軸和頂端分生組織的大豆子葉節(jié)，即得到大豆子葉節(jié)外植體；

4)叢生芽的誘導(dǎo)，將步驟3)中制備的大豆子葉節(jié)外植體接入步驟1)制備的培養(yǎng)基中，置于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24-26℃，濕度為50-70％，光照強(qiáng)度為1500-2000lux，光照時(shí)間為16h，7-10天后得到具有2-5株叢生芽的子葉節(jié)外植體；

5)大量叢生芽的誘導(dǎo)，將步驟4)中獲得的長(zhǎng)有2-5株叢生芽的子葉節(jié)外植體取出，切除大叢生芽，繼續(xù)將其置于步驟1)中配置的培養(yǎng)基上并于溫室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為24-26℃，濕度為50-70％，光照強(qiáng)度為1500-2000lux，光照時(shí)間為16h，培養(yǎng)10-15天后獲得具有20-40株叢生芽的子葉節(jié)外植體。

進(jìn)一步地，步驟2)中乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70-80％。

進(jìn)一步地，步驟2)中過氧化氫的體積分?jǐn)?shù)為15-20％，并且用過氧化氫給種子消毒時(shí)，將種子置于25-28℃振蕩培養(yǎng)箱中黑暗振蕩，轉(zhuǎn)速為100-200r/min。

進(jìn)一步地，步驟2)中將大豆種子消毒滅菌后，再加入的滅菌水的量為剛沒過大豆種子即可，將加有滅菌水的大豆種子培養(yǎng)14-18h，長(zhǎng)出5-8mm胚軸。

進(jìn)一步地，步驟4)中將大豆子葉節(jié)外植體插入所述培養(yǎng)基中的方式為斜插，子葉葉面朝上。

進(jìn)一步地，步驟5)中切除的大叢生芽長(zhǎng)度為2-4cm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：將消毒滅菌后的大豆種子4℃靜置培養(yǎng)，可在縮短萌發(fā)培養(yǎng)時(shí)間的同時(shí)減去萌發(fā)培養(yǎng)基的消耗；培養(yǎng)基各成分的配比及種子預(yù)處理，能夠提供優(yōu)良的可供遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，經(jīng)誘導(dǎo)后可誘導(dǎo)出大量?jī)?yōu)良健壯的叢生芽，且獲得時(shí)間為20-25天，并且具有污染率低、叢生芽狀態(tài)良好的優(yōu)點(diǎn)，與現(xiàn)有技術(shù)誘導(dǎo)大豆叢生芽需要30-50天相比，本發(fā)明建立的大豆外植體快速高效誘導(dǎo)叢生芽體系能夠極大的縮減大豆萌發(fā)時(shí)間及叢生芽的獲得時(shí)間，為以大豆子葉節(jié)為轉(zhuǎn)化外植體為基礎(chǔ)的高效擴(kuò)繁體系及遺傳轉(zhuǎn)化體系研究提供重要的技術(shù)平臺(tái)和支持。

附圖說明

下面結(jié)合附圖及實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：

圖1為利用本發(fā)明的方法制得的具有2-5株叢生芽的子葉節(jié)外植體；