[發(fā)明專利]一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法及其應用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610005687.7
• 申請日: 2016-01-04
• 公開（公告）號: CN105441480A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設計）人: 張恒木;羊健;張芬;李靜;陳劍平
• 申請（專利權）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 浙江一墨律師事務所 33252
• 代理人: 黃娟

1.一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法，包括以下步驟：

1)引物設計：通過本實驗室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列共設計4條引物，其中引物對R1f/R1r用于擴增RNA1,引物對R2f/R2r用于擴增RNA2；

2)病毒基因組擴增反應：以病毒基因組cDNA作模板，采用高保真的PhusionDNA聚合酶進行擴增，其中引物對R1f/R1r擴增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-kb，引物對R2f/R2r擴增的RNA2產(chǎn)物長約3.6-kb；

3)病毒基因組克?。翰《救L基因組RNA1、RNA2擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，采用In-Fusion克隆試劑盒參照商家說明書分別連接至線性化的雙元載體質粒上，測序驗證獲得分別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組雙元載體質粒，然后利用電轉化儀將含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組質粒分別導入農(nóng)桿菌；

4)人工接種：將含有中國小麥花葉病毒基因組的農(nóng)桿菌等量混合，然后通過注射器將農(nóng)桿菌混合液浸潤入植物體內(nèi)，2周后進行病毒分子檢測并觀測植株表型變化。

2.根據(jù)權利要求1所述的簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法的應用，包括以下步驟：經(jīng)人工接種中國小麥花葉病毒的植株，分別置于12、15、17、20、25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，二周后進行病毒分子檢測并分析病毒在不同溫度下的復制等特性。