[發(fā)明專利]一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610005687.7
• 申請日: 2016-01-04
• 公開（公告）號: CN105441480A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設計）人: 張恒木;羊健;張芬;李靜;陳劍平
• 申請（專利權）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84
• 代理公司: 浙江一墨律師事務所 33252
• 代理人: 黃娟

技術領域

本發(fā)明涉及一種重要作物病毒的人工接種方法及其應用，尤其是一種簡單快速接種中國小麥花葉病毒的方法及其應用。

背景技術

中國小麥花葉病毒(Chinesewheatmosaicvirus，CWMV)是我國上世紀末在山東發(fā)現(xiàn)的一種土傳病毒，現(xiàn)已劃入帚狀病毒科(familyVirgaviridae)菌傳桿狀病毒屬(genusFurovirus)。CWMV在小麥病株上引起典型的癥狀包括：幼葉呈現(xiàn)褪綠條紋，老葉則黃化甚至變成紫色。嚴重的病株矮縮、萎蔫甚至死亡，從而導致產(chǎn)量損失嚴重。分子鑒定顯示棒狀的CWMV粒子內部含有2條單鏈正義RNA(ssRNA)基因組片段，分別稱為RNA1和RNA2。基因組測序分析表明RNA1長7147nt，編碼3個病毒運動和復制所必需的蛋白；而RNA2則較短，僅3564nt，編碼4個蛋白，其中3個與病毒外殼蛋白有關，另一個則是富含半胱氨酸的RNA沉默抑制子。在自然條件下，中國小麥花葉病毒，由土壤專性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)傳播，該類病毒在真菌介體的休眠孢子中存活數(shù)載，這給該類病害的防控帶來了嚴重困難。由于其介體禾谷多黏菌高度專性寄生，十分難以人工體外培養(yǎng)；在自然條件下，禾谷多黏菌種群復雜多樣，加之土壤中微生物群落復雜多樣，也難以獲得高效傳播CWMV的禾谷多黏菌純系，因此，CWMV自然條件下的介體傳播接種模式至今仍然無法在實驗室條件下進行，這給CWMV及相關病毒的深入研究和生物學特性分析帶來了困擾；另一方面，CWMV雖然能夠摩擦接種，但其效率有限，也難以在抗病篩選和CWMV深入研究中發(fā)揮作用。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術的缺點，提供一種簡單快速高效的接種中國小麥花葉病毒的方法及其應用。

本發(fā)明解決其技術問題采用的技術方案：一種快速高效的接種中國小麥花葉病毒的方法，包括以下步驟：

1)引物設計：通過本實驗室測定的中國小麥花葉病毒基因組片段RNA1和RNA2序列共設計4條引物，引物序列見表1，其中引物對R1f/R1r用于擴增RNA1,引物對R2f/R2r用于擴增RNA2；

2)病毒基因組擴增反應：以病毒基因組cDNA作模板，采用高保真的DNA聚合酶(NEB)進行擴增，其中引物對R1f/R1r擴增的RNA1產(chǎn)物長約7.2-kb，引物對R2f/R2r擴增的RNA2產(chǎn)物長約3.6-kb；

3)病毒基因組克隆：病毒全長基因組RNA1、RNA2擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后，采用In-Fusion克隆試劑盒(Clontech)參照商家說明書分別連接至線性化的雙元載體質粒上，測序驗證獲得分別含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組雙元載體質粒，然后利用電轉化儀將含RNA1和RNA2全長cDNA片段的重組質粒分別導入農(nóng)桿菌；

4)人工接種：將含有CWMV基因組的農(nóng)桿菌等量混合，然后通過注射器將農(nóng)桿菌混合液浸潤入植物體內，2周后進行病毒分子檢測并觀測植株表型變化；

一種快速高效的接種中國小麥花葉病毒的方法的應用，包括以下步驟：

病毒溫敏性分析：經(jīng)人工接種CWMV的植株，分別置于12、15、17、20、25℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)，二周后進行病毒分子檢測并分析病毒在不同溫度下的復制等特性。

表1本發(fā)明所設計的引物