[發(fā)明專利]一種凝血因子基因突變的定點(diǎn)修復(fù)載體系統(tǒng)及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610005683.9
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105567735A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李大力;關(guān)玉婷;王立人;劉明耀
• 申請（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861;A61K48/00;A61P7/04
• 代理公司: 上海麥其知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種對凝血因子F8/F9進(jìn)行原位修復(fù)的方法，其特征在于，步驟包括：

(1)在目標(biāo)基因組序列中，選定凝血因子基因的突變位點(diǎn)為原位修復(fù)的基因位點(diǎn)；

(2)根據(jù)選定的基因原位修復(fù)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)CRISPR/Cas系統(tǒng)的sgRNA序列的核酸酶的結(jié)合 位點(diǎn)；

(3)設(shè)計(jì)用于原位修復(fù)的同源重組修復(fù)供體序列；

(4)將核酸酶蛋白和/或sgRNA、所述同源重組修復(fù)供體的核酸序列通過遞送載體輸送 至原位修復(fù)的基因位點(diǎn)或安全基因座當(dāng)中，其中核酸酶蛋白是CRISPR/Cas9蛋白，或與上述 蛋白具有同源性的能夠引起特異位點(diǎn)產(chǎn)生DNA單鏈或雙鏈斷裂的核酸酶及其組合；

(5)通過核酸酶在所述基因原位修復(fù)位點(diǎn)造成基因組DNA損傷；

(6)所述同源重組供體序列插入到所述基因原位修復(fù)位點(diǎn)內(nèi)，修復(fù)基因或補(bǔ)充基因的 表達(dá)；

其中，

所述步驟(1)中，通過在正義鏈上尋找突變位點(diǎn)附近的N₂₀NGG，或者在反義鏈上尋找突 變位點(diǎn)附近的CCNN₂₀，來確定CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)所原位修復(fù)的靶點(diǎn)，其中所述突變位 點(diǎn)是指導(dǎo)致凝血因子失去功能或活性降低或缺失的突變位點(diǎn)；

步驟(2)中，可以根據(jù)血友病患者所攜帶的基因突變來設(shè)計(jì)同源重組修復(fù)供體DNA序 列，其中所述基因突變選自單堿基或多堿基缺失；

步驟(3)中，所述同源重組修復(fù)供體序列為同源重組修復(fù)序列，其包括用于原位修復(fù)單 堿基缺失突變的編碼凝血因子CDS的部分序列、用于原位修復(fù)多堿基缺失突變的編碼凝血 因子的序列，以及用于原位修復(fù)全基因缺失突變的編碼凝血因子全基因CDS的序列；

步驟(4)中，遞送載體選自慢病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、單鏈寡核苷酸、線形DNA、環(huán)形 DNA、被納米材料或者DNA導(dǎo)入相關(guān)材料包裹的DNA或者RNA之任意一種或多種的組合；

步驟(5)中，所述同源重組修復(fù)供體序列插入到所述基因編輯位點(diǎn)內(nèi)來修復(fù)基因或補(bǔ) 充基因的表達(dá)；

步驟(6)中，所述安全基因座為經(jīng)過驗(yàn)證可對其進(jìn)行基因原位修復(fù)并不會對健康造成 威脅的基因位點(diǎn)。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，F(xiàn)9突變位點(diǎn)所對應(yīng)的sgRNA序列選自SEQID NO.1-241中的一條或多條sgRNA序列，靶點(diǎn)的位置位于安全基因座(safeharbor)包括但不 限于AAVS1、CCR5、Albumin等等。

3.如權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于，所述多堿基缺失是基因片段缺失或全基因缺 失，所述修復(fù)供體序列包含或由SEQIDNO：242中的序列組成，并且所述同源重組修復(fù)供體 序列中包括用于修復(fù)凝血因子為野生型的兼并突變、或引入具有比野生型凝血因子更強(qiáng)凝 血活性的新的突變?nèi)鏔IXR338L。

4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中可預(yù)先在HEK293T細(xì)胞或 HEK293或HEK239A或HEK293FT細(xì)胞中擴(kuò)增、濃縮相關(guān)病毒載體。

5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(4)中不通過遞送載體，直接Cas9重 組蛋白通過納米材料、轉(zhuǎn)染試劑等導(dǎo)宿主細(xì)胞，或直接通過體外轉(zhuǎn)染的方法將Cas9重組蛋 白導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以減少外援核酸的進(jìn)入，降低外援DNA隨機(jī)整合進(jìn)入基因組DNA的概率。