[發明專利]基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略的生物分子檢測方法

有效

• 申請號: 201610005486.7
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105624165B
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 王磊;姜瑋;李偉
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 董潔

1.基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略檢測蛋白質的方法，其特征是，所述方法用于非治療和非診斷的目的，包括以下步驟：

(1)鏈取代擴增反應：將含有目標物的待檢測物與自鎖式適體探針結合，折疊成三向螺旋結構，打開5’端信號轉導序列與部分3’端適體序列形成的莖-環結構；上述體系在DNA聚合酶、切刻內切酶和dNTP存在時，發生鏈取代擴增反應，產生大量的引物序列1；

(2)雙重指數型擴增滾環擴增：將步驟(1)中引物序列1與模板1雜交，觸發第一級指數型RCA擴增反應，產生大量的引物序列2；引物序列2與模板2雜交，觸發第二級指數型RCA擴增反應，產生大量的G-四倍體序列，插入熒光分子后，產生熒光信號通過檢測到的熒光信號對蛋白質或生物小分子進行定量測定；

若是待檢測物中不含有目標物時，不發生鏈取代擴增反應和雙重指數型擴增滾環擴增反應，則沒有熒光信號；

所述目標物為蛋白質；所述蛋白質為血小板源生長因子BB；

所述的自鎖式適體探針至少包括兩個部分：對目標物具有特異性識別的3’端的適體序列和5’端的信號轉導序列，所述5’端的信號轉導序列與部分適體序列雜交，形成5’端莖-環結構，所述5’端的信號轉導序列包含切刻內切酶的識別位點；所述的自鎖式適體探針還包括用來連接適體序列和信號轉導序列的連接序列，所述連接序列用來參與形成5’端莖-環結構；所述的自鎖式適體探針在3’端的適體序列還連接配合序列；

所述的自鎖式適體探針為血小板源生長因子BB的自鎖式適體探針，序列：GCT GTG GATACT GCT GAG GCC ACA GGC TAC GGCACG TAG AGC ATC ACC ATG ATC CTG TG，如SEQ IDNo：6所示；

所述模板1核苷酸序列為：TAC TGC TGA GGG AGT TGA GTG CTG AGG GAG TTGAGT GCTGAG GCT GTG GA，如SEQ ID No：4所示；所述模板2核苷酸序列為：AGT GCT GAG GAA ACCCAA CCC GCC CTA CCC GCTGAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGAGTT G，如SEQID No：5所示。

2.如權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(1)中，SDA反應的步驟為：將含有目標物的待檢測物和自鎖式適體探針進行第一次孵育反應，孵育之后加入具有鏈置換活性的DNA聚合酶、切刻內切酶、dNTPs、緩沖液和水進行第二次孵育反應，最后通過加熱使SDA反應終止。

3.如權利要求1所述的方法，其特征是，步驟(2)中具體反應步驟為：引物序列1與模板1雜交，在DNA聚合酶的作用下觸發線性RCA反應，產生一條長的單鏈DNA產物；該產物與模板1雜交，暴露出切刻內切酶的識別位點，從而被切刻內切酶切刻，產生大量的引物序列2；而游離的引物1/模板1復合物進行下一個聚合、切刻循環，完成第一級指數型RCA擴增；最后，引物序列2與模板2雜交，觸發第二級指數擴增反應，產生大量的G-四倍體序列，插入熒光分子后，產生熒光信號通過檢測到的熒光信號對蛋白質或生物小分子進行定量測定。

4.一種檢測蛋白質的試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括：(1)自鎖式適體探針；所述自鎖式適體探針序列：GCT GTG GAT ACT GCT GAG GCC ACA GGC TAC GGCACG TAG AGC ATCACC ATG ATC CTG TG，如SEQ ID No：6所示；

(2)DNA聚合酶、切刻內切酶、T4DNA連接酶；

(3)dNTPs、熒光分子和KCl溶液；

(4)Cutsmart緩沖液、T4DNA 連接酶的緩沖液；

(5)模板1和模板2；

所述模板1核苷酸序列為：TAC TGC TGA GGG AGT TGA GTG CTG AGG GAG TTGAGT GCTGAG GCT GTG GA，如SEQ ID No：4所示；所述模板2核苷酸序列為：AGT GCT GAG GAA ACCCAA CCC GCC CTA CCC GCTGAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGAGTT G，如SEQID No：5所示。