[發(fā)明專利]基于自鎖式適體探針的級聯(lián)擴(kuò)增策略的生物分子檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610005486.7
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105624165B
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王磊;姜瑋;李偉
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 董潔

1.基于自鎖式適體探針的級聯(lián)擴(kuò)增策略檢測蛋白質(zhì)的方法，其特征是，所述方法用于非治療和非診斷的目的，包括以下步驟：

(1)鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)：將含有目標(biāo)物的待檢測物與自鎖式適體探針結(jié)合，折疊成三向螺旋結(jié)構(gòu)，打開5’端信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列與部分3’端適體序列形成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)；上述體系在DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶和dNTP存在時(shí)，發(fā)生鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的引物序列1；

(2)雙重指數(shù)型擴(kuò)增滾環(huán)擴(kuò)增：將步驟(1)中引物序列1與模板1雜交，觸發(fā)第一級指數(shù)型RCA擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的引物序列2；引物序列2與模板2雜交，觸發(fā)第二級指數(shù)型RCA擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的G-四倍體序列，插入熒光分子后，產(chǎn)生熒光信號通過檢測到的熒光信號對蛋白質(zhì)或生物小分子進(jìn)行定量測定；

若是待檢測物中不含有目標(biāo)物時(shí)，不發(fā)生鏈取代擴(kuò)增反應(yīng)和雙重指數(shù)型擴(kuò)增滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，則沒有熒光信號；

所述目標(biāo)物為蛋白質(zhì)；所述蛋白質(zhì)為血小板源生長因子BB；

所述的自鎖式適體探針至少包括兩個(gè)部分：對目標(biāo)物具有特異性識別的3’端的適體序列和5’端的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列，所述5’端的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列與部分適體序列雜交，形成5’端莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，所述5’端的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列包含切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)；所述的自鎖式適體探針還包括用來連接適體序列和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)序列的連接序列，所述連接序列用來參與形成5’端莖-環(huán)結(jié)構(gòu)；所述的自鎖式適體探針在3’端的適體序列還連接配合序列；

所述的自鎖式適體探針為血小板源生長因子BB的自鎖式適體探針，序列：GCT GTG GATACT GCT GAG GCC ACA GGC TAC GGCACG TAG AGC ATC ACC ATG ATC CTG TG，如SEQ IDNo：6所示；

所述模板1核苷酸序列為：TAC TGC TGA GGG AGT TGA GTG CTG AGG GAG TTGAGT GCTGAG GCT GTG GA，如SEQ ID No：4所示；所述模板2核苷酸序列為：AGT GCT GAG GAA ACCCAA CCC GCC CTA CCC GCTGAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGAGTT G，如SEQID No：5所示。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(1)中，SDA反應(yīng)的步驟為：將含有目標(biāo)物的待檢測物和自鎖式適體探針進(jìn)行第一次孵育反應(yīng)，孵育之后加入具有鏈置換活性的DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶、dNTPs、緩沖液和水進(jìn)行第二次孵育反應(yīng)，最后通過加熱使SDA反應(yīng)終止。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，步驟(2)中具體反應(yīng)步驟為：引物序列1與模板1雜交，在DNA聚合酶的作用下觸發(fā)線性RCA反應(yīng)，產(chǎn)生一條長的單鏈DNA產(chǎn)物；該產(chǎn)物與模板1雜交，暴露出切刻內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)，從而被切刻內(nèi)切酶切刻，產(chǎn)生大量的引物序列2；而游離的引物1/模板1復(fù)合物進(jìn)行下一個(gè)聚合、切刻循環(huán)，完成第一級指數(shù)型RCA擴(kuò)增；最后，引物序列2與模板2雜交，觸發(fā)第二級指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的G-四倍體序列，插入熒光分子后，產(chǎn)生熒光信號通過檢測到的熒光信號對蛋白質(zhì)或生物小分子進(jìn)行定量測定。

4.一種檢測蛋白質(zhì)的試劑盒，其特征是，所述試劑盒包括：(1)自鎖式適體探針；所述自鎖式適體探針序列：GCT GTG GAT ACT GCT GAG GCC ACA GGC TAC GGCACG TAG AGC ATCACC ATG ATC CTG TG，如SEQ ID No：6所示；

(2)DNA聚合酶、切刻內(nèi)切酶、T4DNA連接酶；

(3)dNTPs、熒光分子和KCl溶液；

(4)Cutsmart緩沖液、T4DNA 連接酶的緩沖液；

(5)模板1和模板2；

所述模板1核苷酸序列為：TAC TGC TGA GGG AGT TGA GTG CTG AGG GAG TTGAGT GCTGAG GCT GTG GA，如SEQ ID No：4所示；所述模板2核苷酸序列為：AGT GCT GAG GAA ACCCAA CCC GCC CTA CCC GCTGAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGAGTT G，如SEQID No：5所示。