[發明專利]基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略的生物分子檢測方法

有效

• 申請號: 201610005486.7
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105624165B
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 王磊;姜瑋;李偉
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 董潔

本發明公開了基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略的生物分子檢測方法，該探針至少包括兩個部分：對目標物具有特異性識別的3’端的適體序列和5’端的信號轉導序列，所述5’端的信號轉導序列與部分適體序列雜交，形成5’端莖?環結構，所述5’端的信號轉導序列包含切刻內切酶的識別位點。該探針結合鏈取代擴增(SDA)和雙重指數型滾環擴增(DE?RCA)策略，實現了蛋白質?PDGF?BB和小分子?腺苷的超靈敏和高特異性檢測，檢測限分別達3.8×10^?16mol/L和4.8×10^?8mol/L。

技術領域

本發明涉及一種核酸檢測技術領域，具體涉及一種基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略用于蛋白質和小分子物質的高靈敏、高特異性的檢測方法。

背景技術

適體是一類人工合成的、短的單鏈寡核苷酸序列，常被用于生物傳感、診斷和治療等領域。適體通常具有特定且緊湊的二級或三級結構，對其相應的目標物具有高的親和力和選擇性。與抗體或抗體片段相比，適體具有穩定、易于合成和修飾、目標物廣泛的特點，其目標物包括蛋白、小分子、金屬離子甚至細胞等。因此，適體已被廣泛用于分子探針的構建。

以適體為基礎的分子探針主要包括兩部分：適體序列和信號序列。適體序列能夠折疊成緊湊的二級或三級結構，同時特異性識別其目標物。一旦適體序列與目標物結合，信號序列即可被釋放產生信號。然而，在實際適體傳感體系中，適體探針通常是過量的。理論計算顯示，適體在未結合目標物時，亦可發生構象轉變，從而產生干擾信號，影響檢測的準確性。為了解決這個問題，一種方法是將適體探針固定在一個異相表面上，通過洗滌將多余的適體探針洗去。這種方法能夠有效避免干擾信號的產生，但是異相界面的引入會導致線性范圍受限及目標物、探針的結合效率降低的缺陷。為了避免這些問題，實現基于適體的均相檢測，另一種方法就是引入一段短的阻滯DNA分子，使其與適體序列的活性部分雜交，形成一個阻滯鏈封閉的適體探針，從而抑制適體的非特異性折疊。然而，由于該阻滯鏈較短(12-15nt)，雙鏈結構的不穩定性會導致阻滯鏈泄露(從適體探針上脫落)，進而導致干擾信號的產生。因此，為了進一步減少干擾信號、提高檢測準確性，構建一個新的、更加穩定的適體探針是十分重要的。

發明內容

本發明為解決上述現有技術的不足，提供一種檢測蛋白質和生物小分子物質的自鎖式適體探針及基于自鎖式適體探針的級聯擴增策略用于蛋白質和小分子物質的高靈敏、高特異性的檢測方法。

本發明采用的技術方案如下：

一種用來檢測蛋白質和生物小分子的自鎖式適體探針，該探針至少包括兩個部分：對目標物具有特異性識別的3’端的適體序列和5’端的信號轉導序列，所述5’端的信號轉導序列與部分適體序列雜交，形成5’端莖-環結構，所述5’端的信號轉導序列包含切刻內切酶的識別位點，該切刻內切酶的識別位點位于5’端的信號轉導序列的3’端。

該設計使得自鎖式適體探針在無目標物時處于自鎖狀態，從而使適體序列在無目標物時不發生折疊。自鎖式適體探針分子通過自身回折，使5’端的信號轉導序列與部分適體序列中互補的堿基對相遇，形成氫鍵結合而成的，稱為發夾結構(或莖-環結構)。

所述3’端的適體序列是用來結合目標物，它是通過指數富集的配體系統進化技術(簡稱SELEX技術)從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反復篩選得到的能以高的親和力和特異性與目標物結合的一段寡核苷酸序列。

本發明設計的自鎖式適體探針可以用來檢測各種生物蛋白分子和生物小分子，所述生物蛋白分子為血小板源性生長因子BB(PDGF-BB)，生物小分子為腺苷。通過改變適體序列和設計探針，該方法也可被用于其它生物分子的檢測。

優選的，當適體序列5’端部的堿基不適合與信號轉導序列3’端部形成氫鍵時，該探針還包括用來連接適體序列和信號轉導序列的連接序列，所述連接序列用來參與形成5’端莖-環結構，保證信號轉導序列與部分適體序列可以雜交形成莖-環結構。