[發明專利]從大豆中提取葉酸的方法

有效

• 申請號: 201610004854.6
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105440036B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 張玲;孟繁磊;張原宇;王玉民;李海云;邢國杰;董英山
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C07D475/04
• 分類號: C07D475/04;G01N21/31
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙)11368
• 代理人: 孫國棟

技術領域

本發明屬于植物提取物的制備，具體地涉及一種大豆種子的提取和含量的測定方法。

背景技術

葉酸是水溶性B維生素，葉酸缺乏會引起嬰兒神經管缺陷、癌癥和心血管疾病等嚴重的健康問題(Kimetal.,1998；Geisel,2003；Choi&Friso,2005；Marisaetal.,2005)。人類和動物不能自身合成葉酸，各種作物是人類和動物獲取這一維生素的主要來源。然而，在作物中葉酸的含量通常很低，尤其是在谷物中含量更低，如何獲得作物中各種葉酸衍生物含量的可靠數據是這一研究領域的關鍵問題。作物中葉酸的提取，常用的有單酶法和三酶法。單酶法針對菠菜、黃瓜、卷心菜和香蕉等食物中的葉酸提取有效(Iwatanietal.,2003；Zhangetal.,2005)。三酶法對谷物類，土豆，豆類等的葉酸含量的提取效率高于單酶法，三酶法相對于單酶法能夠更完全地提取富含碳水化合物或蛋白基質的葉酸(DeSouza&Eitenmiller,1990；Tamuraetal,1997；Pffeiferetal,1997；Raderetal,1998；Aiso&Tamura,1998)。Hyun等(2005)研究的食物葉酸提取步驟，適量樣品在提取液中研磨成勻漿，勻漿液分裝后凍存于-70℃直至葉酸提取，加入蛋白酶處理樣品后，100℃煮沸樣品滅活蛋白酶，再利用α-淀粉酶和葉酸軛合酶共同孵育樣品2小時，經離心后獲取葉酸樣品，與-70℃凍存樣品。但是不同食物中使用的三酶法提取條件是不同的(Aiso&Tamura,1998；Pandrangietal.,2004)，有必要對每種類型食物分別進行葉酸提取的優化。

目前國內國際流行的作物中葉酸含量檢測方法是微生物法和高效液相色譜法。高效液相色譜法利用C₁₈色譜柱進行樣品分離后，結合紫外吸收，熒光檢測和電化學檢測能夠對單個葉酸組分進行定量分析。高效液相色譜法能夠快速、高效地分離不同葉酸衍生物，樣品用量少，但是該方法的靈敏度低于微生物法，而且內源葉酸會干擾葉酸測定，給某些形式的葉酸定量帶來困難(Zhangetal.,2005；Póo-Prietoetal.,2006)。微生物法(MicrobiologicalAssay)是檢測葉酸的經典方法，其原理是指示菌對葉酸的所有衍生物具有相同的生長反應速度，在一定條件下，微生物的生長繁殖與培養基中葉酸含量呈正比關系，根據微生物對樣品中葉酸的吸收程度從而對葉酸進行定量(常娜寧等，2010)。酪乳酸桿菌對單谷氨酸葉酸、二或三谷氨酸葉酸及其還原型衍生物均敏感，是最為常用的菌種(Hyunetal.,2005)。葉酸分析中要求不同樣品具有適當的稀釋倍數，使用96孔酶標板對指示菌進行18-24h培養，并在分光光度計讀取數值后計算樣品中葉酸的含量。微生物法靈敏度高，結果準確，但重復性較差,而且只能檢測總葉酸含量,但優點是不需要貴重的儀器或藥品,所以成本較低,適用于大批量的樣品檢測。

綜上，有必要對大豆葉酸三酶法提取和微生物檢測的方法進行優化，確定三種酶的最佳配比和微生物法檢測的步驟，為篩選高葉酸含量的大豆優異種質提供科學的依據。

發明內容

發明旨在解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在于提供一種大豆種子葉酸的提取和含量檢測方法，旨在建立三酶法提取及微生物檢測大豆種子中葉酸含量的方法，為篩選高葉酸含量的大豆優異種質提供科學的依據。

本發明用到的材料和儀器如下：

一、材料和試劑

常規藥品為國產分析純試劑；磷酸緩沖液(AMERESCO公司生產)；葉酸(Sigma公司)；α-淀粉酶(來源于米曲霉)和蛋白酶(來源于鏈霉素)(Sigma公司)；大鼠血清(中科晨宇(北京)貿易有限公司)；乳酸菌液體培養基和葉酸培養基購自北京鼎國生物技術有限公司；乳酸菌菌株購自北京中原合聚經貿有限公司；

二、儀器與設備

AXYGEN系列EP管(自經科宏達公司)；葉酸檢測試劑盒(P1001)購自德國拜發生物有限公司；高通量組織研磨機SPEXGeno2000(美國SPEX公司生產)；3-30K高速臺式冷凍離心機(德國SIGMA)；酶標儀(美國DynexMagellanBiosciences)。

本發明提供了一種大豆種子葉酸的提取方法，包括以下步驟：