[發(fā)明專利]一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610004491.6
• 申請(qǐng)日: 2016-01-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105441569B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張全偉;趙興緒;王琪;張勇;馬友記
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：制備牦牛FOXO3基因擴(kuò)增產(chǎn)物：首先提取牦牛血液基因組DNA，將其稀釋后，以基因組DNA為模版，以牦牛FOXO3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)1、特異性引物對(duì)2、特異性引物對(duì)3和特異性引物對(duì)4，PCR擴(kuò)增牦牛FOXO3基因，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后純化，取純化后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果鑒定牦牛FOXO3基因，并找出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)；

步驟二：合成高低溫內(nèi)標(biāo)：通過(guò)高分辨率熔解曲線分析牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的DNA探針，進(jìn)行基因型分析，合成高低溫內(nèi)標(biāo)，并對(duì)熔解曲線進(jìn)行校正，所述牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的DNA探針包括針對(duì)FOXO3基因98077A/G位點(diǎn)的探針、針對(duì)FOXO3基因98109A/G位點(diǎn)的探針、針對(duì)FOXO3基因98226G/C位點(diǎn)的探針；

步驟三：制備HRM-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：取FOXO3基因的基因組DNA，加入步驟二所述的牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的DNA探針，進(jìn)行HRM-PCR擴(kuò)增，得到HRM-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

步驟四：收集熒光信號(hào)：將步驟二合成的高低溫內(nèi)標(biāo)稀釋，并與步驟三制備的HRM-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物混合，于高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)中收集熒光信號(hào)，通過(guò)不同的熒光檢測(cè)結(jié)果確定檢測(cè)SNP位點(diǎn)處堿基突變的基因型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述特異性引物對(duì)1為：

上游引物：5′CTCCAGACAAACGGCTCACT 3'；

下游引物：5′CCCAACACCTACCCACCC 3'；

所述特異性引物對(duì)2為：

上游引物：5′CCCCGCATCTCCTGAATA 3'；

下游引物：5′CCGCAATGGTCCAACTGA 3'；

所述特異性引物對(duì)3為：

上游引物：5′TGACGGTGGGAAGAGTGG 3'；

下游引物：5′CGCTGTGGCTGAGTGAGT 3'；

所述特異性引物對(duì)4為：

上游引物：5′GGTGGGAAGAGTGGCAAGG 3'；

下游引物：5′TGGTGGAGCAAGTTCTGATT 3'。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述特異性引物對(duì)1擴(kuò)增長(zhǎng)度為157bp，其PCR擴(kuò)增位置為1242-1398；所述特異性引物對(duì)2擴(kuò)增長(zhǎng)度為196bp，其PCR擴(kuò)增位置為97148-97343；所述特異性引物對(duì)3擴(kuò)增長(zhǎng)度為734bp，其PCR擴(kuò)增位置為97467-98200；所述特異性引物對(duì)4擴(kuò)增長(zhǎng)度為890bp，其PCR擴(kuò)增位置為97471-98360。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，復(fù)性30s，特異性引物對(duì)1的PCR擴(kuò)增退火溫度為56℃，特異性引物對(duì)2的PCR擴(kuò)增退火溫度為59℃，特異性引物對(duì)3的PCR擴(kuò)增退火溫度為58℃，特異性引物對(duì)4的PCR擴(kuò)增退火溫度為59℃，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。