[發明專利]一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態性的檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201610004491.6
• 申請日: 2016-01-05
• 公開（公告）號: CN105441569B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: 張全偉;趙興緒;王琪;張勇;馬友記
• 申請（專利權）人: 甘肅農業大學
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：制備牦牛FOXO3基因擴增產物：首先提取牦牛血液基因組DNA，將其稀釋后，以基因組DNA為模版，以牦牛FOXO3基因序列設計特異性引物對1、特異性引物對2、特異性引物對3和特異性引物對4，PCR擴增牦牛FOXO3基因，得到PCR擴增產物后純化，取純化后PCR擴增產物測序，根據測序結果鑒定牦牛FOXO3基因，并找出單核苷酸多態性位點；

步驟二：合成高低溫內標：通過高分辨率熔解曲線分析牦牛FOXO3基因單核苷酸多態位點的DNA探針，進行基因型分析，合成高低溫內標，并對熔解曲線進行校正，所述牦牛FOXO3基因單核苷酸多態位點的DNA探針包括針對FOXO3基因98077A/G位點的探針、針對FOXO3基因98109A/G位點的探針、針對FOXO3基因98226G/C位點的探針；

步驟三：制備HRM-PCR擴增產物：取FOXO3基因的基因組DNA，加入步驟二所述的牦牛FOXO3基因單核苷酸多態位點的DNA探針，進行HRM-PCR擴增，得到HRM-PCR擴增產物；

步驟四：收集熒光信號：將步驟二合成的高低溫內標稀釋，并與步驟三制備的HRM-PCR擴增產物混合，于高分辨率熔解曲線分析系統中收集熒光信號，通過不同的熒光檢測結果確定檢測SNP位點處堿基突變的基因型。

2.根據權利要求1所述的一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述特異性引物對1為：

上游引物：5′CTCCAGACAAACGGCTCACT 3'；

下游引物：5′CCCAACACCTACCCACCC 3'；

所述特異性引物對2為：

上游引物：5′CCCCGCATCTCCTGAATA 3'；

下游引物：5′CCGCAATGGTCCAACTGA 3'；

所述特異性引物對3為：

上游引物：5′TGACGGTGGGAAGAGTGG 3'；

下游引物：5′CGCTGTGGCTGAGTGAGT 3'；

所述特異性引物對4為：

上游引物：5′GGTGGGAAGAGTGGCAAGG 3'；

下游引物：5′TGGTGGAGCAAGTTCTGATT 3'。

3.根據權利要求2所述的一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述特異性引物對1擴增長度為157bp，其PCR擴增位置為1242-1398；所述特異性引物對2擴增長度為196bp，其PCR擴增位置為97148-97343；所述特異性引物對3擴增長度為734bp，其PCR擴增位置為97467-98200；所述特異性引物對4擴增長度為890bp，其PCR擴增位置為97471-98360。

4.根據權利要求2所述的一種牦牛FOXO3基因單核苷酸多態性的檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為：95℃預變性3min，94℃變性30s，復性30s，特異性引物對1的PCR擴增退火溫度為56℃，特異性引物對2的PCR擴增退火溫度為59℃，特異性引物對3的PCR擴增退火溫度為58℃，特異性引物對4的PCR擴增退火溫度為59℃，72℃延伸30s，35個循環，72℃延伸10min，4℃保存。