[發明專利]一種誘導浙貝母小鱗莖的組培方法

有效

• 申請號: 201610004006.5
• 申請日: 2016-01-06
• 公開（公告）號: CN105519435B
• 公開（公告）日: 2017-10-13
• 發明（設計）人: 蔡寶昌;張彥南;金俊杰;秦昆明;陳丹妮;黃雨婷;范孟雪;鄭艷萍;陳林偉;王彬
• 申請（專利權）人: 南京海源中藥飲片有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 楊海軍

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及浙貝母組織培養與繁殖的方法，是一種誘導培養浙貝母小鱗莖的新方法。

背景技術

浙貝母(Fritillaria thunbergii)是臨床常用的大宗中藥材之一，被列為“浙八味”之首，歷版《中國藥典》均有收載，具有清熱散結，化痰止咳的功能。目前，在浙貝母生產上主要有狹葉種、寬葉種、多籽種及小三子4個栽培品種。其中以狹葉種浙貝母種植面積最廣，并且于2007年通過新品種認定，定名為浙貝1號；寬葉種浙貝母于2014年被認定為浙貝2號。由于浙貝母種子采收后經種植到鱗莖生長到能用于生產需要5年，有性繁殖周期長，目前生產上采用鱗莖繁殖。但浙貝母無性繁殖系數一般為2，并且由于不能通過有性生殖過程阻斷病毒的繼代危害，病毒在鱗莖中不斷累積，導致品種退化、產量和品質降低，鱗莖變小，商品性狀受到較大影響，浙貝母休眠期長、用種量大、繁殖率低成為生產上的主要問題。組織培養可以顯著提高浙貝母的繁殖率，且生長周期明顯縮短。目前，浙貝母離體快繁主要有2種途徑：一、器官間接發生途徑：浙貝母通過外植體誘導愈傷組織，繼而誘導再生苗是目前研究最多的一種快繁方式，但由于該方法需要經過細胞脫分化和再分化獲得組培苗，該途徑存在大量的遺傳變異，不利于浙貝母優良品質的遺傳。二、器官直接發生途徑：該途徑不經過愈傷組織，浙貝母外植體直接誘導出不定芽或小鱗莖，可避免細胞分化和再分化導致的遺傳變異，對保持浙貝母種質優良性狀具有積極作用，但是浙貝母通過該種途徑實現快繁的技術缺乏研究，存在諸多不足。

發明內容

發明目的：本發明的目的是為了解決現有技術的不足，提供一種方法簡單、可減少多次繼代培養的過程、繁殖速度快、培養周期短、經濟效益好的高效誘導浙貝母小鱗莖的方法。

技術方案：為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種誘導浙貝母小鱗莖的組培方法，其特征在于，它包括以下步驟：

(1)切取外植體：選取無病害的浙貝母鱗莖，剝開鱗片，從鱗莖基部切取浙貝母的芯芽，得到外植體；

(2)滅菌：用自來水沖洗浙貝母的芯芽，放入超凈工作臺，用體積濃度70％～75％乙醇消毒，用無菌水沖洗3～6次，再放入體積濃度為0.1～0.2％的升汞中滅菌，用無菌水沖洗3～6次，并用無菌濾紙吸干浙貝母的芯芽表面的水份；

(3)成苗培養：將滅菌后的浙貝母的芯芽接種于成苗培養基中培養，經培養后，芯芽抽莖成苗，高5～9cm；

(4)誘導培養：將成苗接種于誘導培養基中培養，經誘導培養后，苗大部分葉腋處逐漸出現白色膨大，統計小鱗莖誘導率；

(5)膨大培養：從葉片基部切取誘導培養出的小鱗莖，接種到膨大培養基上進行培養，膨大培養基為MS+蔗糖60g/L+瓊脂6g/L，pH為5.5～6.5，培養條件為：溫度22～26℃，光照強度2000～3000Lux，光照時間10～14h，培養時間為30～35天，統計小鱗莖膨大率，培養得到浙貝母小鱗莖。

作為優選方案，以上所述的誘導浙貝母小鱗莖的組培方法，步驟(2)滅菌過程為：用自來水沖洗浙貝母的芯芽15min，放入超凈工作臺，用體積濃度70％～75％乙醇消毒15～20s，用無菌水沖洗3～6次，再放入體積濃度為0.1～0.2％的升汞中滅菌5～15min，用無菌水沖洗3～6次，并用無菌濾紙吸干浙貝母的芯芽表面的水份。

作為優選方案，以上所述的誘導浙貝母小鱗莖的組培方法，步驟(3)所述的成苗培養基由MS培養基，蔗糖30g/L和瓊脂6g/L組成，pH為5.5～6.5；成苗培養條件為：溫度22～26℃，光照強度2000～3000Lux，光照時間10～14h，培養時間為25～30天。

作為優選方案，以上所述的誘導浙貝母小鱗莖的組培方法，步驟(4)所述的誘導培養：將成苗接種于誘導培養基中培養，誘導培養基由MS培養基，1.5mg/L的NAA，0.5mg/L的KT，30g/L的蔗糖和6g/L瓊脂組成，pH為5.5～6.5；誘導培養條件為：溫度22～26℃，光照強度2000～3000Lux，光照時間10～14h，培養時間為20～30天。

作為優選方案，以上所述的誘導浙貝母小鱗莖的組培方法，步驟(5)所述的膨大培養：從葉片基部切取誘導培養出的小鱗莖，接種到膨大培養基上進行培養，膨大培養基由MS培養基，60g/L蔗糖和6g/L瓊脂組成，pH為5.5～6.5；膨大培養條件為：溫度22～26℃，光照強度2000～3000Lux，光照時間10～14h，培養時間為30～35天。