[發(fā)明專利]一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探針序列在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610003794.6 | 申請日： | 2016-01-04 |
| 公開（公告）號： | CN105441593A | 公開（公告）日： | 2016-03-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 李基棕;江杰元;李文良;毛立;郝飛;楊蕾蕾;張紋紋 | 申請（專利權(quán)）人： | 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93 |
| 代理公司： | 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200 | 代理人： | 張素卿 |
| 地址： | 210014 江*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 檢測 山羊 流感病毒 核苷酸 片段 引物 探針 序列 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于動物病原微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸的引物和探針序列。
背景技術(shù)
副流感病毒3型(PIV3)屬于副粘病毒科呼吸道病毒屬成員，是有囊膜的單股負鏈RNA病毒。該屬成員還包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1、HPIV3)、仙臺病毒和牛副流感病毒3型(BPIV3)。副流感病毒3型宿主范圍廣泛，在自然和實驗室條件下均可感染人和多種動物，包括小鼠、豚鼠、牛、馬、鹿、犬、貓、豬、綿羊和山羊等。人副流感病毒1型和3型是導致嬰幼兒上下呼吸道感染的重要病原；仙臺病毒是實驗小鼠的重要呼吸道病原體，常造成實驗室幼鼠的大量死亡；牛副流感病毒3型可引起牛的“運輸熱”，當呼吸道有致病性細菌或支原體繼發(fā)感染時，會引起犢牛大批死亡，給養(yǎng)牛業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。
牛的呼吸道疾病綜合征又稱為“運輸熱”，臨床上以發(fā)熱、咳嗽、食欲減退、眼睛鼻部分泌物增多，并伴有腹瀉為特征。1959年，美國科學家首次證實該病與牛副流感病毒3型有關(guān)，并成功分離到病原體。目前，牛副流感病毒3型已在全球范圍內(nèi)流行，尤其以亞洲和美洲發(fā)病率最高。我國于2008年之后陸續(xù)有牛副流感病毒3型感染的報道，并證實存在BPIV3a和BPIV3c兩個基因型。
目前關(guān)于羊群中山羊副流感病毒3型感染的報道較少，本研究室自2013年起在江蘇、安徽等地的山羊養(yǎng)殖場羊群中檢測到副流感病毒3型，發(fā)病羊群臨診表現(xiàn)以呼吸道癥狀為主。經(jīng)過RT-PCR檢測、病毒分離鑒定、血凝試驗和測序分析，證實該病毒與人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型均存在較大差異，在進化上處于獨立的分支，命名為山羊副流感病毒3型JS2013(李文良,等.山羊源副流感病毒3型的分離與分子鑒定.畜牧獸醫(yī)學報.2015)。
然而，對山羊副流感病毒3型在國內(nèi)的流行情況尚無詳實數(shù)據(jù)，對于該病原的診斷方法主要以病毒的分離鑒定和中和試驗為主，這兩種方法耗時長，不適合疾病的快速診斷，熒光定量PCR敏感性高、特異性強、檢測時間短、無需進行核酸電泳即可以進行定量分析，是傳統(tǒng)方法無法比擬的。
因此，基于以上的研究和當前的需要，申請人根據(jù)山羊副流感病毒3型全基因組序列(GenBank登錄號：KT215610)，設(shè)計了用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探針，建立熒光定量PCR方法。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探針序列。
技術(shù)方案
本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
1、一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物對，其特征在于所述的引物對為：由序列為GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列為GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR組成的引物對。
2、一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的探針，其特征在于所述的探針CPIVTM序列為CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。
所述引物對和探針序列用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法，包括：
1)待測模板的制備：取100μl血清；或取100mg肺組織，加入500μlPBS緩沖液進行充分研磨，-20℃反復凍融3次，12000rpm離心10分鐘，取上清液100μl。加入400μlTRIzol試劑，劇烈振蕩30秒，室溫孵育5-10分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄沉淀，加入100μl氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫孵育5-10分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相至另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻10次，室溫孵育30分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75％乙醇(DEPC處理的水配置)，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4℃，12000rpm離心5分鐘，盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5-10分鐘，用20μl無RNase水溶解，即為檢測用RNA模板；
2)使用TaKaRa公司OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit配制反應體系：
將加好樣品的PCR管置于熒光定量PCR儀中進行擴增，反應程序如下：42℃，5分鐘，反轉(zhuǎn)錄；95℃，10秒預變性；95℃，5秒，60℃34秒，40個循環(huán)。試驗結(jié)果可以實時監(jiān)測。
該專利技術(shù)資料僅供研究查看技術(shù)是否侵權(quán)等信息，商用須獲得專利權(quán)人授權(quán)。該專利全部權(quán)利屬于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院，未經(jīng)江蘇省農(nóng)業(yè)科學院許可，擅自商用是侵權(quán)行為。如果您想購買此專利、獲得商業(yè)授權(quán)和技術(shù)合作，請聯(lián)系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/201610003794.6/2.html，轉(zhuǎn)載請聲明來源鉆瓜專利網(wǎng)。
