[發(fā)明專利]一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物和探針序列

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610003794.6
• 申請日: 2016-01-04
• 公開（公告）號: CN105441593A
• 公開（公告）日: 2016-03-30
• 發(fā)明（設計）人: 李基棕;江杰元;李文良;毛立;郝飛;楊蕾蕾;張紋紋
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的引物對和探針序列，其特征在于，所述的引物對為：由序列為GCTTGGCTTCTTTGAAATGG的上游引物CPIVTF和序列為GCCTGCAGAAGTTCCTTGTC的下游引物CPIVTR組成的引物對；探針CPIVTM序列為CAATCGGACTAGCCAAGTATGGTGGGA。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述引物對和探針序列,其特征在于,所述引物對和探針序列用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法，包括：

1）待測模板的制備：取100μl血清或取100mg組織樣品，加入500μlPBS緩沖液進行充分研磨，-20℃反復凍融3次，12000rpm離心10分鐘，取上清液100μl;

加入400μlTRIzol試劑，劇烈振蕩30秒，室溫孵育5-10分鐘，12000rpm離心5分鐘，棄沉淀，加入100μl氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫孵育5-10分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，吸取上層水相至另一新離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻10次，室溫孵育30分鐘，4℃，12000rpm離心15分鐘，棄上清，RNA沉淀于管底，加入500μl75%乙醇（DEPC處理的水配置），溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，4℃，12000rpm離心5分鐘，盡量棄上清，室溫晾干或真空干燥5-10分鐘，用20μl無RNase水溶解，即為檢測用RNA模板；

2）使用TaKaRa公司OneStepPrimeScript^TMRT-PCRKit配制反應體系：

試劑用量/終濃度

2×OneStepRT-PCRBufferⅢ10μl/1×

TaKaRaExTaqHS(5U/μl)0.4μl

PrimeScriptRTEnzymeMixⅡ0.4μl

PCRForwardPrimer(10μM)0.4μl/0.2μM

PCRReversePrimer(10μM)0.4μl/0.2μM

TaqManProbe(10μM)0.8μl/0.4μM

ROXReferenceDyeⅠ(50×)0.4μl/1×

TotalRNA2μl

RNaseFreedH₂O5.2μl

將加好樣品的PCR管置于熒光定量PCR儀中進行擴增，反應程序如下：42℃，5分鐘，反轉(zhuǎn)錄；95℃，10秒，預變性；95℃，5秒，60℃34秒，40個循環(huán);

山羊副流感病毒3型實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果判定：經(jīng)檢測，若待檢樣品中含有山羊副流感病毒3型核苷酸則顯示陽性擴增曲線，其檢測靈敏度可達10個拷貝/ml；若待檢樣品中不含有山羊副流感病毒3型核苷酸則無擴增信號。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述引物對和探針序列,其特征在于,所述引物對和探針序列用于檢測山羊副流感病毒3型核苷酸片段的方法中其檢測靈敏度達10個拷貝/ml。

4.含有權(quán)利要求1所述引物對和探針序列的試劑盒。

5.權(quán)利要求1所述引物對和探針序列在制備用于檢測山羊副流感病毒3型的試劑盒產(chǎn)品中的應用。