[發明專利]用于無抗生素發酵制備低分子量物質和蛋白質的微生物菌株和方法

有效

• 申請號: 201580085273.3
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN108463546B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: C·博恩霍德;M·托恩
• 申請（專利權）人: 瓦克化學股份公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/00;C12N9/10;C12N9/12
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

本發明涉及微生物菌株和用于物抗生素發酵制備低分子量物質和蛋白質的方法。用于生產低分子量物質或蛋白質的微生物菌株在其基因組中含有基因中的突變，所述突變在所述菌株中引起營養缺陷。其進一步含有編碼酶或重組蛋白和基因的功能性拷貝的生產質粒，所述酶用于生產低分子量物質，所述基因的染色體失活引起營養缺陷，其中所述營養缺陷是不可補足的營養缺陷。

本發明涉及用于無抗生素發酵生產低分子量物質和蛋白質的微生物菌株和方法。

首要地，借助于微生物的低分子量物質的自然生產已經增多，重組蛋白藥物(“生物制劑”)的市場近年來也呈現強勁增長。由于發酵生產(特別是對于基于蛋白質的活性藥物成分)中的高成本壓力，正在尋求更有效且因此更具成本效益的用于其生產的方法和系統。各種微生物，如細菌、酵母、絲狀真菌或其它植物細胞或動物細胞均可用作生產者。在此，從經濟角度來看至關重要的是經濟有效的發酵、高產物產量及在蛋白質的情況中的獲得功能性蛋白質的正確折疊和/或修飾。由于其經廣泛研究的遺傳學和生理學、短的傳代時間和簡便處理，革蘭氏陰性腸桿菌大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)是目前最常用于生產低分子量物質和蛋白質的生物體。

基本上，使用兩種不同的微生物：天然產生所述物質的微生物及已經遺傳修飾的微生物。遺傳修飾所需的技術方法在現有技術中已久為人所知。在此的目標是將靶蛋白質需要的或者合成低分子量物質需要的基因導入宿主細胞。所述基因由宿主細胞轉錄、翻譯、必要時修飾，且可能向外轉移到培養基中。

生物技術方法的經濟可行性關鍵取決于所得產物的產量。所述產量可以通過表達系統(宿主細胞，遺傳元件等)、發酵參數和培養基而優化。

基本上，宿主細胞可以通過兩種不同的方式進行修飾。從而，可以將新的遺傳信息整合進基因組(絲狀真菌，酵母等)和/或導入染色體外元件上(例如質粒)(原核生物，酵母等)。在將基因遺傳整合進基因組中的情況中，即使沒有選擇壓力，所述基因在宿主細胞中仍然良好保持。然而，缺點是在原核生物情況中，宿主中只有一個基因拷貝，且由于序列特異性重組事件，整合相同基因的進一步的拷貝，以通過基因-劑量效應增加產物形成是非常具有挑戰性的(EP 0284126B1)。

當使用染色體外DNA時，通常將質粒形式的靶蛋白的遺傳信息轉化進大腸桿菌生產菌株中。由于基因-劑量效應在此也產生作用，因此爭取盡可能最高的每個細胞的質粒拷貝數。由于這種遺傳因子因脅迫而容易從細胞丟失(歸因于質粒的復制以及靶蛋白的產生)，因此有必要對整個培養施加選擇壓力。標準的是使用抗生素抗性基因作為選擇標記，這使得包含這種元件的細胞在抗生素存在下能夠生長。因此，只有攜帶質粒的細胞可以繁殖。由于產生靶物質或靶蛋白質的能力也由于質粒丟失而喪失，這對于在發酵中可以達到的產量有直接影響。

近年來，使用抗生素抗性作為選擇標記越來越受到關注。首先，抗生素的使用相當昂貴，尤其是當抗性基于抗生素降解酶時，因為需要不斷提供額外劑量的抗生素。其次，在醫學和其它領域的廣泛使用促成抗性基因擴散到其它菌株，在某些情況中是致病性菌株。這對疾病的治療具有負面影響。

同時，現有技術中也開發了無抗生素選擇系統。已經開發了多種不同的無抗生素系統。這些可以分為三種不同的基本系統。使用營養缺陷型、毒素-抗毒素系統及其它方法。

其它方法的類別涵蓋不遵循一般原理的機制，例如抑制因子tRNA、fab I/三氯生(FA合成)、操縱子/阻抑物滴定(Peubez et al.Microbial Cell Fac,2010,9:65)。然而，這些方法通常用于合成用于基因治療的DNA和DNA片段，未優化用于產生高產量的靶物質。在一些情況中，代替抗生素用于選擇的是其它物質，例如三氯生、除草劑和重金屬，但也會引起健康問題。例如Herrero et al.(1990,J.Bacteriol.172,6557–6567)描述了作為選擇標記的除草劑和重金屬抗性基因。