[發(fā)明專利]用于無抗生素發(fā)酵制備低分子量物質(zhì)和蛋白質(zhì)的微生物菌株和方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580085273.3
• 申請日: 2015-12-11
• 公開（公告）號: CN108463546B
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·博恩霍德;M·托恩
• 申請（專利權(quán)）人: 瓦克化學(xué)股份公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P21/00;C12N9/10;C12N9/12
• 代理公司: 永新專利商標(biāo)代理有限公司 72002
• 代理人: 左路;林曉紅

1.用于生產(chǎn)低分子量物質(zhì)或蛋白質(zhì)的微生物菌株，其基因組中含有基因中的突變，該突變在菌株中引起營養(yǎng)缺陷，所述菌株還含有編碼至少一種酶或者至少一種重組蛋白以及所述基因的功能性拷貝的生產(chǎn)質(zhì)粒，所述酶用于生產(chǎn)低分子量物質(zhì)，所述基因的染色體失活引起營養(yǎng)缺陷，特征在于營養(yǎng)缺陷是不可補足的營養(yǎng)缺陷，且所述基因是pyrH基因或其同源基因，其中所述不可補足的營養(yǎng)缺陷指所述營養(yǎng)缺陷降低微生物細(xì)胞的生長或者導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡，且不能通過在生長培養(yǎng)基中加入代謝特異性前體、中間體和/或終產(chǎn)物而補足，并且所述同源基因與pyrH基因編碼相同的蛋白質(zhì)并且與pyrH基因具有大于30％的序列相同性。

2.權(quán)利要求1的微生物菌株，特征在于在菌株中引起不可補足的營養(yǎng)缺陷的基因突變導(dǎo)致所述基因失活。

3.權(quán)利要求1或2的微生物菌株，特征在于在所述菌株中引起不可補足的營養(yǎng)缺陷的基因突變導(dǎo)致所述基因編碼的基因產(chǎn)物的活性失活。

4.產(chǎn)生權(quán)利要求1-3任一項的菌株的方法，特征在于將溫度敏感型質(zhì)粒導(dǎo)入微生物菌株，該菌株具有這樣的基因：其能夠通過突變或缺失轉(zhuǎn)變?yōu)樵诰曛幸鸩豢裳a足的營養(yǎng)缺陷的基因，所述溫度敏感型質(zhì)粒具有待突變或缺失的基因的功能性拷貝，然后突變所述菌株的基因組，由此所述菌株在所述基因中具有導(dǎo)致菌株中不可補足的營養(yǎng)缺陷的突變，及所述基因的功能性拷貝存在于溫度敏感型質(zhì)粒上，然后在所述菌株中在非許可溫度用生產(chǎn)質(zhì)粒交換所述溫度敏感型質(zhì)粒，其中所述生產(chǎn)質(zhì)粒含有編碼用于產(chǎn)生低分子量物質(zhì)的酶或重組蛋白質(zhì)的基因，以及引起營養(yǎng)缺陷的基因的功能性拷貝，其中所述基因是pyrH基因或其同源基因，其中所述不可補足的營養(yǎng)缺陷指所述營養(yǎng)缺陷降低微生物細(xì)胞的生長或者導(dǎo)致微生物細(xì)胞死亡，且不能通過在生長培養(yǎng)基中加入代謝特異性前體、中間體和/或終產(chǎn)物而補足，并且所述同源基因與pyrH基因編碼相同的蛋白質(zhì)并且與pyrH基因具有大于30％的序列相同性。

5.權(quán)利要求4的方法，其特征在于所述溫度敏感型質(zhì)粒具有溫度敏感的復(fù)制起點。

6.權(quán)利要求5的方法，特征在于細(xì)胞在用所述生產(chǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后立即暴露于47-55℃的溫度休克30-90分鐘，并且隨后在37-45℃的非許可溫度進(jìn)行進(jìn)一步的溫育。

7.在發(fā)酵培養(yǎng)基中用微生物菌株生產(chǎn)低分子量物質(zhì)或蛋白質(zhì)的方法，所述方法的特征在于使用權(quán)利要求1-3任一項的微生物菌株及使用無抗生素發(fā)酵培養(yǎng)基。