[發明專利]用于對試樣進行光片顯微檢測的方法

有效

• 申請號: 201580076570.1
• 申請日: 2015-11-18
• 公開（公告）號: CN107430266B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: 托馬斯·卡爾克布萊納;海爾穆特·里佩爾特;喬治·吉本摩爾根
• 申請（專利權）人: 卡爾蔡司顯微鏡有限責任公司
• 主分類號: G02B21/36
• 分類號: G02B21/36;G02B21/10;G02B21/00
• 代理公司: 北京市創世宏景專利商標代理有限責任公司 11493
• 代理人: 崔永華

本發明涉及一種用于對試樣(1)進行光片顯微檢測的方法，其中，選擇多個曝光波長，基于所述多個曝光波長將針對試樣(1)的曝光光線集中起來。針對平均波長，將相位選擇元件的調制深度確定為π。這里，對于相位選擇元件表現出預設的相分布并且對于孔板平面的孔板(24)表現出預設的孔板結構，其實現了，基于多個曝光波長將曝光光線集中起來且利用從多色組成的光片對試樣(1)曝光。為此，選出優先波長，且在曝光物鏡(10)的焦平面中，針對預設形狀的光片，利用優先波長的光確定出光片的電場。由此計算出要預設的相分布。相位選擇元件被以曝光光線曝光，并且曝光光線借助于相位選擇元件結構化。經結構化的曝光光線成像到孔板平面中，多色的經結構化的光線的零階在孔板平面中被消隱，使得在布置于后面的曝光物鏡(10)的焦平面中，成形有經結構化的光片，具有垂直于曝光物鏡(10)的焦平面設置的光片平面。試樣(1)被以結構化的光片在光片平面中曝光，從試樣射出的光線沿檢測方向得到檢測，檢測方向與光片平面圍成不為零的角度。

技術領域

本發明涉及一種用于對試樣進行光片顯微檢測的方法以及主要涉及對利用多種染料標記的試樣進行分析的問題。

背景技術

對生物試樣的研究在近年來越來越重要，其中，試樣的照射被利用光片實現，光片的平面(光片平面)與檢測的光軸(檢測方向)夾成不為零的角度相交。通常，光片平面在此與檢測方向(一般相對于檢測物鏡的光軸)夾成不為零的、但通常也不一定是直角的角度。這種研究方法主要用在熒光顯微成像中并且被歸納為術語LSFM(光片熒光顯微術)。示例是在DE10257423A1以及以上述文獻為基礎構成的WO2004/0535558A1介紹的而且稱為SPIM(選擇性平面照明顯微術)的方法，利用這種方法，在相對短的時間內也能夠在空間上容納比較厚的試樣：基于光學剖面，在與沿垂直于剖切平面的方形的相對運動組合下，能夠對試樣進行圖像上/空間上拉伸的顯示。

相對于其他設計的方法，諸如共焦激光掃描顯微術或者雙光子顯微術，LSFM方法具有多種優點。因為能夠實現在寬視場內的檢測，所以能夠檢測更大的試樣區域。雖然分辨率略低于共焦激光掃描顯微術的情況，但是，能夠利用LSFM技術分析較厚的試樣，因為透入深度較大。此外，在這種方法中，對試樣的光負荷加載最低，這降低了試樣褪色的風險，因為試樣僅受到薄的光片以相對于檢測方向不為零的角度照射。

替代純靜置的光片，也可以產生一定程度上靜置的光片，方式為：試樣以光束快速掃描。光片類型的照明以如下方式產生，光束相對于需要觀察的試樣經歷非常快速的相對運動并且在此，在時間上彼此跟隨地多重地并排排列。在此，照相機的在其傳感器上成像出試樣的合成時間以如下方式選擇，使得掃描在積分時間內結束。

光片顯微術的主要應用在于對幾百微米直至幾毫米的中等大小的生物體的成像。一般，生物體嵌入凝膠中，例如瓊脂中，凝膠又處在玻璃毛細管中。玻璃毛細管從上方或從下方被嵌入填入水的試樣腔室中，并且試樣作為一塊被從毛細管中壓出。瓊脂中的試樣被以光片照明，并且熒光利用成像物鏡(其優選、但是一定垂直于光片、進而也垂直于用于產生光片的光學系統的照明物鏡而置)成像到照相機上。

但是，光片顯微成像術的方法具有一定局限。一方面，需要研究的試樣相對較大，該試樣來自發展生物學。第二方面，由于試樣制備和試樣腔室的尺寸，光片相對較厚并且進而能夠實現的軸向解析度受到限制。第三，試樣的制備很復雜并且不與針對單個細胞的熒光顯微術的標準試樣制備和標準試驗固定相兼容。

為了部分地規避上述限制，在近年來，實現了新型的結構，其中，照明物鏡和檢測物鏡優選彼此垂直而置并且以45°的角度朝向上方指向試樣。操作方式例如在WO2012/110488A1以及在WO2012/122027A1中介紹。