[發明專利]類固醇的21-羥基化

有效

• 申請號: 201580071490.7
• 申請日: 2015-10-29
• 公開（公告）號: CN108138215B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發明（設計）人: C·拉特曼;T·施蒂爾格;B·雅諾哈;H-F·賴斯;S·里瑟姆;S·安德爾克;R·伯恩哈特;F·漢內曼
• 申請（專利權）人: 賽諾菲
• 主分類號: C12P33/06
• 分類號: C12P33/06
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 史悅

概括而言，本發明涉及類固醇羥化領域。更具體而言，本發明涉及用于在細胞中對類固醇進行21?羥化的方法。還涉及表達類固醇21?羥基化酶(steroid 21?hydroxylating enzyme)或類固醇21?羥化酶(steroid 21?hydroxylase)的細胞、包含編碼類固醇21?羥化酶的核酸的表達載體和用于實施在細胞中對類固醇進行21?羥化的方法的試劑盒。

說明書

概括而言，本發明涉及類固醇羥化領域。更具體而言，本發明涉及用于在細胞中對類固醇進行21-羥化的方法。還涉及表達類固醇21-羥基化酶(steroid 21-hydroxylatingenzyme)或類固醇21-羥化酶(steroid 21-hydroxylase)的細胞、包含編碼類固醇21-羥化酶的核酸的表達載體和用于實施在細胞中對類固醇進行21-羥化的方法的試劑盒。

合成糖皮質激素衍生自天然存在的應激激素皮質醇，并且因為它們的抗炎和免疫抑制作用而在制藥工業中扮演至關重要的角色。另外，合成分子經常發揮比皮質醇更有效的作用。

目前，一些藥學活性類固醇的合成涉及它們的前體的21-羥化(例如參見圖1)，其由長時間化學多步合成組成。通過合成化學的方式，這種羥化仍然困難，因為化學氧化劑對位置21不具選擇性。出于這一理由，必須要保護其他官能團以避免它們的氧化，并使羥化反應針對位置21進行。另外，因為使用了如碘等試劑，合成對環境不友善。因此，對于藥學活性類固醇廉價且可持續的生產以滿足對這些重要藥物的高需求是高度期望的。

這個問題已經由本發明的發明人通過開發在一步合成中由酶CYP21A2進行類固醇的完整細胞生物轉化而得到了解決，CYP21A2是細胞色素P450單加氧酶(monooxygenases)蛋白家族成員，且能夠在類固醇骨架的21-位進行高度選擇性的類固醇羥化(所述方法的方案參見圖2)。CYP21A2是哺乳動物膜錨定酶，其位于內質網中并且在類固醇激素生物合成中發揮關鍵作用。發明人已經證明本發明的生物催化系統是充滿前景的候選者，可取代已經確立的化學合成。具體來說，他們證明了類固醇能夠在一個單一的羥化步驟中得到修飾，產生一個理想的產物，其省時、對環境友好(未觀察到副產物)并且便于下游加工。此外，有利的是，就本發明在完整細胞中類固醇的生產而言，酶不必經過純化，在宿主中保持穩定，也不必要添加昂貴的氧化還原當量(redox equivalent)如NADPH，因為細胞自身即充當供體。

在下文詳細描述本發明之前，應理解的是本發明不限于此處記載的特定的方法學、方案和試劑，因為這些可以變化。還應理解，此處使用的術語學僅出于描述特定實施方案的目的，而非意圖限制本發明的范圍，本發明的范圍將由所附權利要求的范圍進行限定。除非另行定義，此處使用的全部技術和科學術語與本領域普通技術人員所通常理解的含義相同。

優選地，此處使用的術語如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”,Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和H.編(1995),Helvetica Chimica Acta,CH-4010Basel,Switzerland)中所述進行定義。

本說明書引用了數篇文件。本文引用的每一篇文件(包括全部專利、專利申請、科學出版物、制造商的說明書、指導等)，無論是在前文還是在后文中，均以其整體并入作為參考。不應將本文的任何內容理解成是對本發明無權因為在先發明而先于這些公開內容的承認。

在下文中，將描述本發明的元素。這些元素隨著具體實施方案列出，然而，應該理解的是它們可以以任意方式和任意數量組合以創造出其他具體實施方案。以多種方式描述的實例和優選的實施方案不應理解成將本發明僅限定為明確記載的具體實施方案。應將此說明書理解為支持并涵蓋將明確記載的實施方案與任意數量的公開的和/或優選的元素組合得到的實施方案。另外，在本申請中所有描述的元素的排列組合應被認為由本申請的說明書公開，除非上下文另有說明。