[發(fā)明專利]類固醇的21-羥基化

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580071490.7
• 申請(qǐng)日: 2015-10-29
• 公開（公告）號(hào): CN108138215B
• 公開（公告）日: 2022-01-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: C·拉特曼;T·施蒂爾格;B·雅諾哈;H-F·賴斯;S·里瑟姆;S·安德爾克;R·伯恩哈特;F·漢內(nèi)曼
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 賽諾菲
• 主分類號(hào): C12P33/06
• 分類號(hào): C12P33/06
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 史悅

1.一種用于羥化類固醇的碳原子21的方法，包括以下步驟：

a)提供細(xì)胞，所述細(xì)胞表達(dá)

(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體，

(ii)至少一種能夠?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)移至CYP21A2的異源電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，和

(iii)一種或多種促進(jìn)CYP21A2折疊的分子伴侶；和

b)將類固醇添加至所述細(xì)胞，

其中所述類固醇是medrane或deltamedrane。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括步驟c)從所述細(xì)胞的上清液提取21-羥化類固醇。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟b)之后向所述細(xì)胞添加一種或多種細(xì)胞透化劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞是休眠細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞是原核細(xì)胞，特別是大腸桿菌細(xì)胞，或真核細(xì)胞，特別是酵母細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述至少一種電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括

(i)CYP21A2還原酶，和/或

(ii)鐵氧還蛋白還原酶，特別是NADPH依賴性鐵氧還蛋白還原酶，和鐵氧還蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，所述異源電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包含黃素氧還蛋白還原酶和皮質(zhì)鐵氧還蛋白的組合，黃素氧還蛋白還原酶和電子轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的組合，皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶同源物和皮質(zhì)鐵氧還蛋白的組合，或皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶同源物和電子轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)域的鐵氧還蛋白結(jié)構(gòu)域的組合。

9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述一種或多種分子伴侶是重組表達(dá)的分子伴侶。

10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中至少一種色氨酸酶基因的表達(dá)在所述細(xì)胞中是降低的或廢除的。

11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步表達(dá)異源基因，所述異源基因編碼催化血紅素生物合成途徑中的步驟的酶，特別是hemA基因。

12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述編碼(i)、(ii)和任選的(iii)的基因包含在一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒中，所述一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒整合在所述細(xì)胞基因組中。

13.一種細(xì)胞用于羥化類固醇的碳原子21的用途，其中所述類固醇是medrane或deltamedrane，并且其中所述細(xì)胞表達(dá)

(i)異源CYP21A2蛋白或其功能性變體，

(ii)至少一種能夠?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)移至CYP21A2的異源電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，和

(iii)一種或多種促進(jìn)CYP21A2折疊的分子伴侶。

14.一種多順反子表達(dá)載體用于羥化類固醇的碳原子21的用途，其中所述類固醇是medrane或deltamedrane，其中所述多順反子表達(dá)載體包含(i)編碼CYP21A2蛋白或其功能性變體的核酸，(ii)編碼至少一種能夠?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)移至CYP21A2的異源電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的一種或多種核酸，和任選的(iii)編碼促進(jìn)CYP21A2折疊的分子伴侶的一種或多種核酸。

15.一種試劑盒用于羥化類固醇的碳原子21的用途，其中所述類固醇是medrane或deltamedrane，其中所述試劑盒包含

-權(quán)利要求13中限定的細(xì)胞，

-權(quán)利要求14中限定的多順反子表達(dá)載體，或

-(i)包含編碼CYP21A2蛋白或其功能性變體的核酸的表達(dá)載體，(ii)包含編碼至少一種能夠?qū)㈦娮愚D(zhuǎn)移至CYP21A2的異源電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的一種或多種核酸的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體，和任選的(iii)包含編碼促進(jìn)CYP21A2折疊的分子伴侶的一種或多種核酸的一個(gè)或多個(gè)表達(dá)載體。