[發(fā)明專利]在樣品制備和測序期間使用鐵載體螯合劑減少DNA損傷

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580070229.5
• 申請日: 2015-10-26
• 公開（公告）號: CN107250358B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設計）人: V.P.史密斯;S.德羅齊雷斯
• 申請（專利權）人: 伊盧米納劍橋有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

本公開的實施方案提供了包含鐵載體的用于核酸制備的試劑和試劑盒。本文公開的實施方案提供了用于制備核酸文庫的方法，其包括從樣品提供多個核酸分子；并且在包含鐵載體的用于核酸制備的試劑中操作所述多個核酸分子。此外，本公開的實施方案提供了用于減少對核酸分子的氧化損傷或增加測序反應的Q(phred)得分的方法，該方法包括在不存在EDTA的情況下制備核酸分子。

優(yōu)先權

本申請要求于2014年11月5日提交，標題為““REDUCING DNA DAMAGE DURINGSAMPLE PREPARATION AND SEQUENCING USING SIDEROPHORE CHELATORS”的美國臨時專利申請序列號62/075,708的優(yōu)先權權益，其通過引用以其整體并入本文用于所有目的。

發(fā)明領域

本文提供的實施方案涉及用于下一代測序的方法和組合物。一些實施方案涉及包含鐵載體和電解質的用于測序相關樣品制備的試劑。

發(fā)明背景

螯合劑用于生物化學中以除去或失活可導致反應中有害的和不期望的影響的二價陽離子。由于產生促進有害自由基化學的Fe²⁺(EDTA)復合物，目前在測序相關樣品制備應用中使用的作為螯合劑的EDTA可導致DNA的嚴重和不可逆氧化，特別是在污染鐵的存在下(Lloyd and Phillips,Mutation Res.(1999)424:23-36；Wang et al.,Nuc.Acid Res.(2008)36:e85)。這導致DNA樣本中的局部點突變從而導致深度測序分析期間錯誤的多態(tài)性調用(calls)。這種表型在必須敏感檢測低頻多態(tài)性的癌癥相關的深度測序應用中尤其成問題，并具有重要的生物學意義。

發(fā)明概述

本文公開的實施方案提供了包含鐵載體的用于核酸制備的試劑。在一些實施方案中，鐵載體是細菌鐵載體。在一些實施方案中，鐵載體是去鐵胺B(DFO-B)甲磺酸鹽。在一些實施方案中試劑可以包含DNA聚合酶。在一些實施方案中，試劑可以包含dNTP。在一些實施方案中，試劑不含有EDTA。

本文公開的實施方案提供了制備核酸文庫的方法，其包括：從樣品提供多個核酸分子；并且在包含鐵載體的用于核酸制備的試劑中操作所述多個核酸分子。在一些實施方案中，操作所述多個核酸分子包括將多個核酸分子與多個寡核苷酸探針雜交。在一些實施方案中，將所述多個核酸分子和/或多個寡核苷酸探針固定化在支持物上。在一些實施方案中，通過與所述支持物的結合配偶對將所述多個核酸分子和/或多個寡核苷酸探針固定化在支持物上。在一些實施方案中，所述支持物是磁珠。在一些實施方案中，操作所述多個核酸分子包括除去未特異性結合至所述多個核酸分子的寡核苷酸探針。在一些實施方案中，所述方法包括修飾特異性結合至所述多個核酸分子的寡核苷酸探針。在一些實施方案中，所述方法包括將所述多個核酸分子片段化。在一些實施方案中，所述方法包括將銜接頭添加到所述多個核酸分子。在一些實施方案中，所述通過擴增，將所述銜接頭添加到所述多個核酸分子。

本文公開的實施方案提供了用于減少對核酸分子的氧化損傷的方法，所述方法包括在不存在EDTA的情況下制備所述核酸分子。在一些實施方案中，制備所述核酸分子包括在鐵載體存在的情況下制備所述核酸分子。在一些實施方案中，鐵載體是細菌鐵載體。在一些實施方案中，鐵載體是去鐵胺B(DFO-B)甲磺酸鹽。在一些實施方案中，制備所述核酸分子包括將所述核酸分子暴露于Fe(III)。在一些實施方案中，制備所述核酸分子包含將所述核酸分子暴露于磁珠。在一些實施方案中，所述氧化損傷包含所述核酸分子中的點突變。在一些實施方案中，所述點突變是C至A顛換。