[發明專利]從粗溶液捕獲靶分子

有效

• 申請號: 201580068455.X
• 申請日: 2015-11-18
• 公開（公告）號: CN107001411B
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: R.施庫達斯;K.阿德里安;B.埃德爾曼;M.約恩克
• 申請（專利權）人: 默克專利股份公司
• 主分類號: C07K1/20
• 分類號: C07K1/20;B01D15/32
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;萬雪松

本發明涉及從含有靶肽的溶液分離肽聚集體和片段的方法。

本發明涉及從含有靶肽的溶液分離肽聚集體和片段的方法。

現有技術

由于重組表達的肽用于藥物應用，所以它們需要特別高的純度[E. P. Kroeff，R.A. Owens，E. L. Campbell，R. D. Johnson，H. I. Marks，Journal of Chromatography，461（1989）45-61]。

為了響應更低成本和更高數量的生物治療藥物的市場壓力，許多制造商正在考慮當可能時將微生物表達系統（大腸桿菌（E.coli））作為哺乳動物培養的有吸引力的替代品。微生物表達系統以高生產力和低表達率為特色，但通常以變性狀態獲得靶分子。

一般來說，大腸桿菌（Escherichia coli）培養物用于制造目前市場上大多數重組肽[F. A. O. Marston，Biochem. J.（1986）240,1-12]。這些治療用肽的生產通常在生物反應器中開始，所述生物反應器含有以高速率生產治療用肽的細胞懸浮液，從而導致其在細胞內液中的聚集和形成內含體。然后收獲生長的細胞并使其破裂以獲得含有不溶性靶肽的內含體。在靶分子增溶和再折疊后，使后者經歷一系列過程，包括澄清、過濾和純化，其去除錯折疊的肽、DNA、HCP、聚集體等。這一系列的過程通常被稱為下游過程（DSP）。

最常用的DSP包括一個或兩個結合-洗脫（bind-elute）層析純化步驟，隨后是一個或兩個流通（flow-through）精煉（polishing）步驟。典型的下游純化方法采用填充有多孔的基于珠的層析介質的填充柱或基于膜的設備。這些單元操作被串聯使用，并且每個操作都旨在以流通精煉或結合/洗脫捕獲模式清除顆粒性雜質。精煉介質的主要目的之一是降低聚集體濃度到根據靶肽濃度1％。

如上所述，通常以變性狀態獲得靶分子。這使得純化過程復雜化，這是因為靶分子在最終純化之前被增溶和重折疊。由于這些情況，該方法可能非常低效，這是因為總得率僅在5至10％的范圍內，并且在純化過程中需要至少5個耗時的逐步模式的純化步驟。此外，主要雜質是必須去除的聚集的靶分子。

因此，肽重折疊過程是最具挑戰性的生產步驟之一[A. Jungbauer，Journal ofBiotechnology 128（2007）587-596; A.P.J. Middelberg，Trends in BiotechnologyVol. 20 No. 10 2002年10月，437-443]，從而由于形成不溶性聚集體導致高的靶肽損失。

該方法基于離子交換層析模式的窄應用窗口（例如，pH和溶劑電導率依賴的），所述離子交換層析模式適合于捕獲所期望的靶分子和所需的初級純化，其后是使用許多正交技術（如，尺寸排阻層析、疏水作用等）的附加純化步驟，以達到生物治療分子的規格。此外，實施后續結晶以除去在最終高壓精煉步驟中使用的有機溶劑。

每個靶分子的制造過程各自開發，對應于物理性質和生物治療分子規格，從而增加制造成本和上市時間。

總之，典型的靶肽純化過程是各自開發的，對應于物理性質和生物治療分子規格。各種澄清、過濾和純化步驟用于純化靶肽。例如，一些技術更常見，例如用于EPO純化的離子交換層析和疏水作用層析[WO 03/045996；WO 00/27869；WO2009/147060]。其它方法包括使用疏水聚苯乙烯樹脂（例如，Source 30RP）作為捕獲步驟，隨后直接是離子交換步驟（EP0265222），隨后是羥基磷灰石，用于片段和聚集體分離。

尤其羥基磷灰石的使用對于從微生物表達系統中純化靶分子是非常重要的，這是因為主要工藝雜質是靶分子聚集體（WO 2005/044856；WO 2010/147686）。