[發明專利]一種單體型分型測序文庫的構建方法、分型方法和試劑

有效

• 申請號: 201580068011.6
• 申請日: 2015-01-06
• 公開（公告）號: CN107208314B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 蘆靜;李晟;蔣浩君;康雄斌;陳芳;蔣慧
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號: C40B40/06
• 分類號: C40B40/06;C12Q1/6869;C12N15/00
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;羅瑤

提供了一種單體型分型測序文庫的構建方法、分型方法和試劑，其中單體型分型測序文庫的構建方法包括：使用在一段染色體區域的多個SNP位點附近設計的引物，進行隨機的多重PCR擴增；在擴增片段的兩端分別連接5’?端接頭和3’?端接頭，其中接頭分別具有限制性內切酶的識別位點，其切割位點位于SNP位點的內側；對連接接頭后的片段進行環化；使用限制性內切酶在切割位點切割環狀DNA分子，得到測序文庫。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域中的單體型技術，尤其涉及一種單體型分型測序文庫的構建方法、分型方法和試劑。

背景技術

單體型(Haplotype)是單倍體基因型的簡稱，在遺傳學上是指在同一染色體上共同遺傳的多個基因座上等位基因的組合。通俗的說法就是若干個決定同一性狀的緊密連鎖的基因構成的基因型。按照某一指定基因座上基因重組發生的數量，單體型甚至可以指至少兩個基因座或整個染色體。相鄰的SNP(single nucleotide polymorphism，單苷酸多態性)之間有很高的相關性，往往使得我們可以從染色體上一個位點的狀態來推測另一個位點的狀態。

現有單體型分型軟件比如PHASE(PHylogenetics And Sequence Evolution，序列進化分析)軟件是根據群體基因型重構個體的單體型，連鎖分析(Linkage DisequilibriumAnalyzer，LDA)軟件，是計算兩個位點間的連鎖程度。這些單體型分型技術依賴于基因測序結果。然而，目前用于基因測序的測序文庫存在片段較長的問題，并且受到測序讀長以及組裝技術的限制。此外，單個個體的單體型一直是基于一代Sanger測序來實現的。

發明內容

本發明提供一種單體型分型測序文庫的構建方法、分型方法和試劑，所述單體型分型測序文庫的構建方法能夠將同一染色體或其部分區域上的SNP位點富集起來，形成兩端分別帶有一個SNP位點的小片段測序文庫，能夠大大降低需要測序的片段長度，并且不同的小片段之間保持有相關性，能夠容易地組裝出染色體或其部分區域的單體型。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種單體型分型測序文庫的構建方法，所述方法包括：

使用在一段染色體區域的多個SNP位點附近設計的引物，對待分型個體來源的基因組DNA進行隨機的多重PCR擴增，得到兩端具有所述SNP位點的擴增片段；

在所述擴增片段的兩端分別連接5’-端接頭和3’-端接頭，其中所述5’-端接頭和3’-端接頭分別具有限制性內切酶的識別位點，所述限制性內切酶的切割位點位于所述SNP位點的內側；

對連接5’-端接頭和3’-端接頭后的片段進行環化，得到環狀DNA分子；

使用所述限制性內切酶在所述切割位點切割所述環狀DNA分子，得到包含兩個SNP位點、兩個引物序列和兩個接頭序列的切割片段，即為所述測序文庫。

作為本發明的優選方案，所述多重PCR擴增使用的擴增酶為擴增10kb以上長片段的擴增酶。

作為本發明的優選方案，所述限制性內切酶為Ecop15酶，所述識別位點為AGACC或CAGCAG，所述切割位點位于所述識別位點的下游24-26bp處。

作為本發明的優選方案，在所述擴增片段的兩端分別連接5’-端接頭和3’-端接頭之后，進行缺口平移反應。

作為本發明的優選方案，所述進行缺口平移反應之后，使用結合所述5’-端接頭和3’-端接頭的引物進行PCR擴增，其中所述PCR擴增使用的引物上帶有U堿基位點；使用USER酶切以產生利于環化的粘性末端；環化所述USER酶切得到的兩端帶有粘性末端的片段，得到環狀DNA分子。

作為本發明的優選方案，所述對連接5’-端接頭和3’-端接頭后的片段進行環化之后，消化未環化的線形DNA分子，再進行所述限制性內切酶的切割。