[發(fā)明專利]一種單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法、分型方法和試劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580068011.6
• 申請(qǐng)日: 2015-01-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107208314B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘆靜;李晟;蔣浩君;康雄斌;陳芳;蔣慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳華大智造科技有限公司
• 主分類號(hào): C40B40/06
• 分類號(hào): C40B40/06;C12Q1/6869;C12N15/00
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;羅瑤

1.一種單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：

使用在一段染色體區(qū)域的多個(gè)SNP位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)的引物，對(duì)待分型個(gè)體來(lái)源的基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)的多重PCR擴(kuò)增，得到兩端具有所述SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增片段；

在所述擴(kuò)增片段的兩端分別連接5’-端接頭和3’-端接頭，其中所述5’-端接頭和3’-端接頭分別具有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)位于所述SNP位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)；

對(duì)連接5’-端接頭和3’-端接頭后的片段進(jìn)行環(huán)化，得到環(huán)狀DNA分子；

使用所述限制性內(nèi)切酶在所述切割位點(diǎn)切割所述環(huán)狀DNA分子，得到包含兩個(gè)SNP位點(diǎn)、兩個(gè)引物序列和兩個(gè)接頭序列的切割片段，即為所述測(cè)序文庫(kù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述多重PCR擴(kuò)增使用的擴(kuò)增酶為擴(kuò)增10kb以上長(zhǎng)片段的擴(kuò)增酶。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶為Ecop15酶，所述識(shí)別位點(diǎn)為AGACC或CAGCAG，所述切割位點(diǎn)位于所述識(shí)別位點(diǎn)的下游24-26bp處。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，在所述擴(kuò)增片段的兩端分別連接5’-端接頭和3’-端接頭之后，進(jìn)行缺口平移反應(yīng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述進(jìn)行缺口平移反應(yīng)之后，使用結(jié)合所述5’-端接頭和3’-端接頭的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中所述PCR擴(kuò)增使用的引物上帶有U堿基位點(diǎn)；使用USER酶切以產(chǎn)生利于環(huán)化的粘性末端；環(huán)化所述USER酶切得到的兩端帶有粘性末端的片段，得到環(huán)狀DNA分子。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建方法，其特征在于，所述對(duì)連接5’-端接頭和3’-端接頭后的片段進(jìn)行環(huán)化之后，消化未環(huán)化的線形DNA分子，再進(jìn)行所述限制性內(nèi)切酶的切割。

7.一種非診斷目的的單體型分型方法，其特征在于，所述方法包括：對(duì)所述權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法得到的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序；然后以對(duì)應(yīng)于每個(gè)SNP位點(diǎn)的引物上的標(biāo)簽序列為序列標(biāo)識(shí)，對(duì)所述測(cè)序得到的reads進(jìn)行SNP位點(diǎn)的連鎖關(guān)系分析，得到單體型。

8.一種單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建試劑，其特征在于，所述試劑包括如下組成部分：

引物組，所述引物組包括在一段染色體區(qū)域的多個(gè)SNP位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)的多條引物，用于對(duì)待分型個(gè)體來(lái)源的基因組DNA進(jìn)行隨機(jī)的多重PCR擴(kuò)增，以得到兩端具有所述SNP位點(diǎn)的擴(kuò)增片段；

5’-端接頭和3’-端接頭，分別具有限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)位于所述SNP位點(diǎn)的內(nèi)側(cè)，用于連接在所述擴(kuò)增片段的兩端；

環(huán)化連接酶，用于對(duì)連接5’-端接頭和3’-端接頭后的片段進(jìn)行環(huán)化，得到環(huán)狀DNA分子；

限制性內(nèi)切酶，用于在所述切割位點(diǎn)切割所述環(huán)狀DNA分子，以得到包含兩個(gè)SNP位點(diǎn)、兩個(gè)引物序列和兩個(gè)接頭序列的切割片段。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建試劑，其特征在于，還包括擴(kuò)增酶，所述擴(kuò)增酶擴(kuò)增10kb以上長(zhǎng)片段，用于所述多重PCR擴(kuò)增。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建試劑，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶為Ecop15酶，所述識(shí)別位點(diǎn)為AGACC或CAGCAG，所述切割位點(diǎn)位于所述識(shí)別位點(diǎn)的下游24-26bp處。

11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的單體型分型測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建試劑，其特征在于，還包括缺口平移反應(yīng)的組分，用于在所述擴(kuò)增片段的兩端分別連接5’-端接頭和3’-端接頭之后，進(jìn)行缺口平移反應(yīng)。