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[發明專利]整合轉基因的位點定向CRISPR/重組酶組合物和方法有效

專利信息
申請號: 201580064960.7 申請日: 2015-12-07
公開(公告)號: CN107208079B 公開(公告)日: 2021-06-29
發明(設計)人: R·雁如·蔡 申請(專利權)人: 應用干細胞有限公司
主分類號: C12N9/22 分類號: C12N9/22;C12N15/113
代理公司: 北京市君合律師事務所 11517 代理人: 顧云峰;吳龍瑛
地址: 美國加利*** 國省代碼: 暫無信息
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摘要:
搜索關鍵詞: 整合 轉基因 定向 crispr 重組 組合 方法
【說明書】:

本申請公開了靶向的嵌合多肽、其組合物、表達載體及其使用方法,用于產生轉基因細胞、組織、植物和動物。本發明的組合物、載體和方法也可用于基因治療和細胞治療技術。所述嵌合多肽包括CRISPR?Cas結構域和重組酶結構域。

相關申請的交叉引用

本申請要求2014年12月5日提交的美國臨時專利申請62/088,440的優先權,其公開內容在此參考并入。

發明領域

本發明通常涉及用于將轉基因整合到細胞基因組中的組合物和方法。

背景技術

來源于成簇的、規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)-Cas系統的RNA導向的Cas9核酸酶提供了用于編輯多種生物體的基因組的通用工具。然而,目前基于CRISPR-Cas系統的技術具有有限的插入大片段DNA的能力,并且無法在非分裂細胞(如神經元)或具有DNA同源重組缺陷的細胞中進行基于同源性的編輯,例如靶向轉基因插入。因此,仍然需要新的基因組工程技術,所述技術可負擔得起,易于建立并且能夠在非分裂細胞或具有DNA同源重組缺陷的細胞中編輯基因組。

發明簡述

本申請公開了靶向的嵌合多肽,包括其組合物、表達載體及其使用方法,用于產生轉基因細胞、組織、植物和動物。本發明的組合物、載體和方法也可用于基因治療和細胞治療技術。

一方面,本公開涉及嵌合多肽。該多肽包括:1)CRISPR-Cas結構域和2)重組酶結構域。在各種實施方式中,CRISPR-Cas結構域能夠結合向導RNA,其中所述向導RNA能夠與靶DNA序列雜交,并且重組酶結構域包含位點特異性重組酶、其突變體或其片段。

在一些實施方式中,CRISPR-Cas結構域包含II型Cas9蛋白(SEQ ID NO:1)或其片段。在某些實施方式中,CRISPR-Cas結構域不具有核酸內切酶活性。在某些實施方式中,CRISPR-Cas結構域是失去催化能力的Cas9(dCas9)。在某些實施方式中,CRISPR-Cas結構域包含SEQ ID.1的氨基酸序列。

在一些實施方式中,重組酶結構域包含位點特異性重組酶。在一些實施方式中,位點特異性重組酶是酪氨酸重組酶。酪氨酸重組酶的實例包括但不限于Cre、Flp和λ整合酶。在一些實施方式中,位點特異性重組酶是絲氨酸重組酶。絲氨酸重組酶的實例包括γ-δ解離酶、Tn3解離酶(SEQ ID NO:2)、Sin解離酶、Gin轉化酶、Hin轉化酶、Tn5044解離酶、IS607轉座酶和整合酶。在一些實施方式中,位點重組酶是選自Bxb1、wBeta、BL3、phiR4、A118、TG1、MR11、phi370、SPBc、TP901-1、phiRV、FC1、K38、phiBT1和phiC31(SEQ ID NO.3)的整合酶。

在某些實施方式中,重組酶結構域包含如上所述的位點特異性重組酶的突變型或片段。在某些實施方案中,突變體具有改變的靶特異性。在一些實施方式中,突變體具有降低的靶特異性。在某些實施方式中,重組酶結構域包含重組酶的活化突變體,包括但不限于Tn3的活化突變體和phiC31的活化突變體。在某些實施方式中,重組酶結構域是重組酶的活化突變體的催化結構域。在某些實施方式中,重組酶結構域包含Tn3的活化突變體的催化結構域。在某些實施方式中,重組酶結構域具有選自如表1所列的SEQ ID NO:5及其變體的氨基酸序列。

在某些實施方式中,多肽還包含連接CRISPR-Cas結構域和重組酶結構域的接頭。在某些實施方式中,接頭具有蘇氨酸-絲氨酸的氨基酸序列。

另一方面,本申請公開了包含上文所公開的多肽和向導RNA的組合物。在某些實施方式中,組合物還包含供體DNA,所述供體DNA含有位點特異性重組酶識別的第一核苷酸序列和轉基因。

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