[發明專利]制備小腦祖先組織的方法

在審

• 申請號: 201580059853.5
• 申請日: 2015-09-08
• 公開（公告）號: CN107109361A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 笹井芳樹;六車惠子
• 申請（專利權）人: 國立研究開發法人理化學研究所;住友化學株式會社
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/079;C12N5/10;C12N15/09
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司11021
• 代理人: 賀衛國

[技術領域]

本發明涉及用于在體外誘導人多能干細胞分化成小腦祖先組織的技術。

[背景技術]

小腦是運動系統的主要組成部分，是高度有序的腦結構，具有一些已確定的細胞類型。在包括人的羊膜動物中，小腦的早期發育是保守的。小腦發育的初始階段是形成峽部形成體(isthmic organizer)，其位于中腦-后腦邊界(midbrain-hindbrain boundary，MHB)。在其誘導影響下，在菱腦原節1(r1)的背側區(翼板)中形成小腦原基(cerebellar anlage)(非專利文件1-3)。小腦細胞在r1中的兩個不同的胚區(germinal zone)生成。一個是小腦板的腦室區(ventricular zone，VZ)，其表達堿性螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄因子Ptf1a。Ptf1a⁺祖先細胞產生小腦皮質(浦肯野細胞(Purkinje cell)和中間神經元)和深部小腦核(DCN)的γ-氨基丁酸能神經元(GABAergic neuron)。另一個區是菱唇(rhombic lip，RL)，其表達另一種bHLH因子，即Atoh1(也稱為Math1)。Atoh1⁺祖先細胞產生小腦谷氨酸能神經元，包括顆粒細胞(GC)、單極刷細胞(unipolar brush cell)和大DCN投射神經元(非專利文件4-9)。在這十年來在對小腦細胞分化的控制的理解方面已經取得了很多進展。這些知識已經促進了在體外由多能干細胞產生小腦神經元組成部分的技術進展(非專利文件10-13)。然而，所產生的細胞成分怎樣組裝形成錯綜復雜的小腦構造在很大程度上仍然保持是難以理解的。

本發明人之前報道通過重建三維(3D)培養過程中的自誘導信號傳導微環境可以從小鼠胚胎干細胞(mESC)有效地生成小腦神經元(非專利文件11)。mESC具有響應Fgf2和胰島素在聚集體內形成一些峽部形成體組織的潛力。在那些條件下，當用抑制劑抑制內源性Shh信號傳導時，mESC-衍生的神經祖先細胞分化成表達浦肯野細胞祖先細胞標記Kirrel2(也稱為Neph3)的小腦板NE。另一方面，向培養物中加入BMP信號促進向Atoh1⁺ GC和Tbr1⁺DCN神經元的分化，而其抑制浦肯野細胞在mESC聚集體中的產生。盡管在mESC中能夠成功地誘導小腦神經元分化，但是目前尚未再現小腦原基的3D形成。

已經報道，Fgf19，即小鼠Fgf15(在MHB中表達)的人直向同源物，參與后腦背側祖先細胞的發育(非專利文件14和15)。

SDF1(也稱為CXCL12)，即分泌的針對趨化因子受體4(CXCR4)的配體，在腦膜細胞中表達并在表達CXCR4的外部顆粒(EGL)細胞的遷移中起關鍵作用(非專利文件16-19)。SDF1-或CXCR4-缺陷型小鼠異常發育，具有不規則的外部顆粒層(EGL)和異位存在的浦肯野細胞。

本發明人已經發現Rho相關卷曲螺旋激酶(Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK)的抑制劑阻抑通過分散誘導的多能干細胞(特別是，人多能干細胞)的細胞死亡(專利文件1和2)。

[文件列表]

[專利文件]

專利文件1:JP-A-2008-99662

專利文件2:WO 2008/035110

[非專利文件]

非專利文件1:Wingate，R.J.T，和Hatten，M.E.(1999).The role of the rhombic lip in avian cerebellum development(菱唇在鳥類小腦發育中的作用).Development 126，4395-4404.

非專利文件2:Joyner，A.L.，Liu，A.，和Millet，S.(2000).Otx2，Gbx2and Fgf8interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer(Otx2，Gbx2和Fgf8相互作用以安置并保持中-后腦組織體).Curr.Opin.Cell Biolo.12，736-741.