[發明專利]制備小腦祖先組織的方法

在審

• 申請號: 201580059853.5
• 申請日: 2015-09-08
• 公開（公告）號: CN107109361A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 笹井芳樹;六車惠子
• 申請（專利權）人: 國立研究開發法人理化學研究所;住友化學株式會社
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12N5/079;C12N5/10;C12N15/09
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司11021
• 代理人: 賀衛國

1.用于制備包含小腦祖先組織的人細胞聚集體的方法，其包括使人多能干細胞聚集體在包含胰島素的無血清培養基中進行懸浮培養，并且在所述懸浮培養中，用ROCK抑制劑、TGFβ信號抑制劑和第一成纖維細胞生長因子處理所述人多能干細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其中所述小腦祖先組織是中腦-后腦邊界神經祖先組織。

3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其中在所述懸浮培養中，不用BMP4處理所述人多能干細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體。

4.根據權利要求1-3中任一項所述的制備方法，其中在所述懸浮培養中，不用sonic hedgehog抑制劑處理所述人多能干細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體。

5.根據權利要求1-4中任一項所述的制備方法，其中所述第一成纖維細胞生長因子是FGF2或FGF8。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其包括：

(I)使人多能干細胞聚集體在包含胰島素的無血清培養基中進行懸浮培養，并且在所述懸浮培養中，用ROCK抑制劑、TGFβ信號抑制劑和第一成纖維細胞生長因子處理所述人多能干細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體，從而得到包含中腦-后腦邊界神經祖先組織的人細胞聚集體，以及

(II)使得到的包含中腦-后腦邊界神經祖先組織的人細胞聚集體在無血清培養基中進行進一步的懸浮培養，從而誘導所述神經祖先組織中的神經祖先細胞形成神經上皮結構，由此得到包含小腦板組織的人細胞聚集體。

7.根據權利要求6所述的制備方法，其包括在步驟(I)的懸浮培養中，用第二成纖維細胞生長因子進一步處理所述人多能干細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體。

8.根據權利要求7所述的制備方法，其中所述第二成纖維細胞生長因子是FGF19、FGF17或FGF8。

9.根據權利要求6-8中任一項所述的制備方法，其包括在步驟(II)的懸浮培養中，用SDF1處理包含中腦-后腦邊界神經祖先細胞的人細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體。

10.根據權利要求6所述的制備方法，其包括在步驟(II)的懸浮培養時，用GDF7處理包含中腦-后腦邊界神經祖先細胞的人細胞聚集體或源自其的人細胞聚集體。

11.根據權利要求7或8所述的制備方法，其中所述小腦板組織是包含γ-氨基丁酸能神經祖先細胞和小腦顆粒細胞祖先細胞的神經上皮結構。

12.根據權利要求11所述的制備方法，其中所述神經上皮結構具有背-腹極性。

13.根據權利要求9所述的制備方法，其中所述小腦板組織包含在所述細胞聚集體表層區域上的連續的小腦神經上皮結構和菱唇樣組織。

14.根據權利要求13所述的制備方法，其中所述小腦板組織具有三層結構，所述三層結構包括自頂端面按順序成層的腦室區、浦肯野細胞區和源自菱唇的細胞區。

15.通過根據權利要求1-14中任一項所述的制備方法得到的人細胞聚集體。

16.用于制備人浦肯野細胞、人高爾基細胞或人中間神經元的方法，其包括：

(I)通過根據權利要求6-14中任一項所述的制備方法由人多能干細胞得到包含小腦板組織的人細胞聚集體，

(II)從所得到的人細胞聚集體得到γ-氨基丁酸能神經祖先細胞，以及

(III)將所述γ-氨基丁酸能神經祖先細胞與哺乳動物小腦顆粒細胞祖先細胞共同培養，從而誘導所述γ-氨基丁酸能神經祖先細胞向浦肯野細胞、高爾基細胞或中間神經元的分化。

17.用于制備人小腦顆粒細胞的方法，其包括：

(I)通過根據權利要求6-14中任一項所述的制備方法由人多能干細胞得到包含小腦板組織的人細胞聚集體，

(II)從所得到的人細胞聚集體得到小腦顆粒細胞祖先細胞，以及

(III)將所述小腦顆粒細胞祖先細胞與哺乳動物小腦細胞共同培養，從而誘導向小腦顆粒細胞的分化。