[發(fā)明專利]改善木糖利用的鐵-硫簇蛋白中的突變

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201580054986.3
• 申請日: 2015-08-11
• 公開（公告）號: CN108064269A
• 公開（公告）日: 2018-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A·弗勒利希;B·漢寧森;S·科瓦拉;R·M·策勒
• 申請（專利權(quán)）人: 拉勒曼德匈牙利流動管理有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/06
• 代理公司: 北京泛華偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11280
• 代理人: 郭廣迅;李渤

本發(fā)明提供了一種工程化宿主細胞及其使用方法，所述工程化宿主細胞包含(a)一種或多種編碼與鐵代謝相關(guān)的蛋白的內(nèi)源基因中的一個或多個突變；和(b)至少一種編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的基因。

聯(lián)邦資助的研究或開發(fā)

基于能源部(the Department of Energy)、能源效率與可再生能源辦公室(Office of Energy Efficiency and Renewable Energy)、生物能源技術(shù)辦公室(Bioenergy Technologies Office)的撥款，給予Mascoma的授予號為DE-FC36-08GO18103和給予橡樹嶺國家實驗室(Oak Ridge National Laboratory)的授予號為FWP#CEEB007，本發(fā)明部分由美國政府資助。根據(jù)合同DE-PS02-06ER64304，本發(fā)明還部分由生物能源科學(xué)中心(the Bioenergy Science Center)橡樹嶺國家實驗室—由生物和環(huán)境研究辦公室(theOffice of Biological and Environmental Research)支持的美國能源部(U.S.Department of Energy)生物能源研究中心(Energy Bioenergy Research Center)的資助。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

發(fā)明領(lǐng)域

總的來說，本發(fā)明的領(lǐng)域涉及工程化宿主細胞，其包含(a)一種或多種編碼與鐵代謝相關(guān)的蛋白的內(nèi)源基因中的一個或多個突變；和(b)至少一種編碼具有木糖異構(gòu)酶活性的多肽的基因；以及發(fā)酵纖維素生物質(zhì)以生產(chǎn)包括乙醇的生物燃料的方法。

發(fā)明背景

釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是在由諸如玉米、甘蔗和甜菜的糖基底物商業(yè)性生產(chǎn)“第一代”燃料乙醇中使用的主要生物催化劑。第二代乙醇生產(chǎn)，也稱為纖維素乙醇生產(chǎn)，將碳水化合物來源擴展到更復(fù)雜的多糖，如纖維素和半纖維素，其占大多數(shù)植物細胞壁的很大一部分，因此占大多數(shù)植物材料的很大一部分。

商業(yè)上考慮的用于第二代乙醇生產(chǎn)的原料包括木材，農(nóng)業(yè)殘渣如玉米秸稈和小麥秸稈，甘蔗渣和有目的種植的材料(purpose grown material)如柳枝稷。纖維素和半纖維素必須水解成單體糖，然后使用機械/化學(xué)手段和/或酶水解發(fā)酵。釋放的單體糖包括葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖，在大多數(shù)原料中，葡萄糖和木糖占單體糖的75％以上。為了使纖維素乙醇生產(chǎn)在經(jīng)濟上可行并與第一代乙醇競爭，生物催化劑必須能夠使大多數(shù)(如果不是全部)的可用糖轉(zhuǎn)化為乙醇。

由于釀酒酵母的耐用性、高產(chǎn)率和多年的安全使用，其為用于第一代乙醇生產(chǎn)的優(yōu)選生物。然而，天然存在的釀酒酵母不能將木糖發(fā)酵為乙醇。為了使釀酒酵母成為用于第二代乙醇生產(chǎn)的可行的生物催化劑，其必須能夠發(fā)酵木糖。

已經(jīng)證明了在釀酒酵母中有兩種木糖發(fā)酵的代謝途徑。途徑的主要差異在于木糖向木酮糖的轉(zhuǎn)化。在第一種途徑XR-XDH途徑中，木糖還原酶(XR)將木糖轉(zhuǎn)化為木糖醇，其隨后由木糖醇脫氫酶(XDH)轉(zhuǎn)化為木酮糖。迄今為止，所測試的XR和XDH酶對所需要的輔因子不同，NADH和NADPH，導(dǎo)致難以實現(xiàn)氧化還原平衡。第二種通常嘗試的途徑使用木糖異構(gòu)酶(XI)使木糖直接轉(zhuǎn)化為木酮糖，不需要氧化還原輔因子。來自細菌和真菌系統(tǒng)的XI已經(jīng)成功地用于釀酒酵母中。兩種途徑均利用相同的下游代謝工程：上調(diào)天然木酮糖激酶(XKS1)和戊糖磷酸途徑的四種基因，特別是核酮糖-磷酸3-差向異構(gòu)酶(RPE1)、核糖-5-磷酸酮醇-異構(gòu)酶(RKI1)、轉(zhuǎn)醛醇酶(TAL1)和轉(zhuǎn)酮醇酶(TKL1)(圖1)。使用XI途徑還通常需要刪除天然醛糖還原酶基因(GRE3)以消除由于木糖醇形成引起的產(chǎn)物損失。