[發(fā)明專利]合成核酸的方法和設(shè)備

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580054493.X
• 申請日: 2015-08-18
• 公開（公告）號: CN107109452A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·W·愛夫卡維茨
• 申請（專利權(quán)）人: 分子組裝公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12Q1/68
• 代理公司: 北京易光知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11596
• 代理人: 耿曉兵

相關(guān)申請

本申請要求2014年10月27日提交的美國臨時(shí)專利申請第62/069,067號和2014年8月18日提交的美國臨時(shí)專利申請第62/038,604號的優(yōu)先權(quán)及權(quán)益。每一以上申請的公開內(nèi)容均以其全文引用的方式并入本文中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及合成具有所需序列的聚核苷酸(從頭)且不需要模板的方法和設(shè)備。由此，本發(fā)明能夠制造具有變化序列和變化長度的聚核苷酸文庫以用于研究、基因工程以及基因療法。

背景技術(shù)

基因工程需要確定基因材料的含量的工具以及構(gòu)筑所需基因材料的工具。確定基因材料的含量的工具使得可以在低于$1,000下在約一天內(nèi)對整個(gè)人類基因組測序。(參見生命技術(shù)，新聞稿：Benchtop Ion Proton^TM測序儀，2012年1月10日(Life Technologies,Press Release:Benchtop Ion Proton^TM Sequencer,January 10,2012))。相反，構(gòu)筑所需基因材料(例如從頭DNA合成)的工具并未同步改進(jìn)。作為參照點(diǎn)，在過去的25年，小核酸從頭合成的成本(每個(gè)堿)下降10倍，同時(shí)核酸測序的成本(每個(gè)堿)下降10,000,000倍以上。DNA合成缺乏進(jìn)展目前限制了轉(zhuǎn)譯基因組學(xué)的步伐，即，由此確定個(gè)別序列變異的作用并且用以改進(jìn)治療性治療。

目前，大多數(shù)新生核酸序列使用30多年前研發(fā)的固相亞磷酰胺技術(shù)合成。所述技術(shù)涉及由與天然(或非天然)核酸堿基對應(yīng)的亞磷酰胺試劑構(gòu)建的序列的依序去保護(hù)和合成。亞磷酰胺核酸合成長度受限，然而，這是因?yàn)殚L度大于200個(gè)堿基對(bp)的核酸會歷經(jīng)高斷裂率和副反應(yīng)。另外，亞磷酰胺合成會產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，并且這一廢棄物的處置限制核酸合成器的可用性，并且增加合同寡核苷酸制造成本。(估計(jì)每年對寡核苷酸合成的需要會造成大于300,000加侖的有害化學(xué)廢棄物，包括乙腈、三氯乙酸、甲苯、四氫呋喃以及吡啶。參見勒普羅斯特(LeProust)等人，核酸研究，第38(8)卷，第2522-2540頁，(2010)(Nucleic Acids Res.,vol.38(8),p.2522-2540,(2010))，其以全文引用的方式并入本文中)。因此，需要更有效并且更具成本效益的寡核苷酸合成方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供改進(jìn)的核酸合成方法。本發(fā)明方法提供更快并且更長的聚核苷酸從頭合成。由此，本發(fā)明大大降低合成常規(guī)核酸的總成本。本發(fā)明方法是針對使用核苷酸基轉(zhuǎn)移酶來并入未經(jīng)修飾的3'羥基通過可裂解連接子與抑制因子偶聯(lián)的核苷酸類似物而不依賴模板地合成聚核苷酸。由于存在抑制因子，合成因添加每一新的堿基而停頓，因此連接子發(fā)生裂解，從而分離抑制因子并且離開聚核苷酸，這與天然產(chǎn)生的核苷酸本質(zhì)上相同(即，通過酶識別為進(jìn)一步核苷酸并入的底物)。

本發(fā)明另外包括利用本發(fā)明方法產(chǎn)生定制聚核苷酸的設(shè)備。本發(fā)明的設(shè)備包括提供水性條件的一個(gè)或多個(gè)生物反應(yīng)器和多個(gè)核苷酸類似物來源。生物反應(yīng)器可以是例如儲槽、流槽或多孔板。以固體支撐物起始，通過經(jīng)由核苷酸基轉(zhuǎn)移酶(例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)或無模板指向使DNA或RNA鏈伸長的任何其它酶)的天然活性添加連續(xù)核苷酸使聚核苷酸生長于反應(yīng)器中。在連接子裂解時(shí)，天然聚核苷酸暴露于固體支撐物上。一旦序列完整，支撐物就會裂解掉，留下聚核苷酸，其實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于自然界中所見的聚核苷酸。在一些實(shí)施例中，將設(shè)備設(shè)計(jì)為通過在核苷酸添加之后回收溶液并且將溶液再用于子序列核苷酸添加來回收核苷酸類似物溶液。因此，產(chǎn)生較少廢棄物，并且，與目前先進(jìn)技術(shù)方法相比每個(gè)堿基的總成本降低。在某些實(shí)施例中，生物反應(yīng)器可以包括微流體裝置和/或使用噴墨印刷技術(shù)。

封端基團(tuán)可以包括(例如)帶電部分或空間抑制因子。一般來說，防止核苷酸基轉(zhuǎn)移酶達(dá)成功能構(gòu)形的大分子可以用以抑制寡核苷酸合成。此類大分子可以包括聚合物、多肽、類多肽以及納米粒子。大分子應(yīng)該足夠大以從物理上阻止接近核苷酸基轉(zhuǎn)移酶的活性位點(diǎn)，但又不會大到對反應(yīng)動(dòng)力產(chǎn)生不利改變。大分子可以使用多個(gè)連接分子連接到核苷酸類似物，如下所述。