[發明專利]用于檢測第一和第二表位的空間接近性的方法

在審

• 申請號: 201580053163.9
• 申請日: 2015-09-30
• 公開（公告）號: CN106715724A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: F.范赫梅特;R.維姆伯格-弗里伊德;D.A.M.W.范斯特里普
• 申請（專利權）人: 皇家飛利浦有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N33/542;G01N33/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 唐華東,陳嵐

技術背景

本發明涉及用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法。本發明還涉及一種用于對患病的對象分層的方法，所述方法用于評估治療的適合性和/或用于對象的疾病的結果預后和/或用于患病的對象針對治療的治療抗性的預測和/或檢測。此外，本發明涉及新的試劑盒及其相應的用途。

技術背景

鄰近連接測定法（PLA）是能夠報告兩種蛋白的共定位的方法（參見Weibrecht I.等人，"Proximity ligation assays: A recent addition to the proteomics toolbox", Expert Review of Proteomics, 第7卷，第3期，2010，第401-409頁)）。該方法使用各自用單鏈DNA寡核苷酸標記的兩種抗體。需要這兩種寡核苷酸以由兩個第二DNA寡核苷酸形成閉合環，所述第二DNA寡核苷酸在抗體結合其表位后添加到樣品中。一旦成環，則使用滾環擴增（RCA）來創建數百個圓形模板的拷貝。最后，用熒光團標記的互補探針與RCA產物退火，在兩種蛋白共定位的位置產生亮點。

標準PLA方案（即使用標記的一抗）需要約6.5小時來完成。發生RCA的最長步驟需要約1小時40分鐘并需要酶。除了這種反應需要長時間，酶的使用使得整個測定難以整合到裝置中，這主要是因為敏感性酶的穩定儲存通常是一個問題。因此，期望具有用于通過在患者的組織和/或細胞（細胞團塊）和/或體液上原位染色來確定兩種蛋白的空間接近性或共定位的技術，所述技術不需要使用酶或至少不需要復雜的酶反應，諸如序列擴增等。

WO 2005/059509 A3公開了可用于使用一組共適體構建體來鑒定和定量任何多肽或大分子復合物的組合物和方法。構建結合大分子構建體多肽的獨特表位的適體構建體。那些適體構建體含有表位結合位點、共適體結合位點和可檢測標記物。在同源多肽、分析物-多肽復合物或其它大分子復合物的存在下，共適體彼此締合以產生可檢測的信號。共適體構建體可以通過接頭連接以產生二價適體構建體。

WO 2012/152942 A1涉及用于檢測樣品中的分析物的基于鄰近探針的檢測測定法，并且具體涉及包括使用至少一組至少第一和第二鄰近探針的方法，所述探針各自包含分析物結合結構域和核酸結構域并且可以同時直接或間接結合至分析物，其中至少一個所述鄰近探針的核酸結構域包含發夾結構，所述發卡結構可以通過切割核酸結構域而解折疊以產生與所述樣品中的另一核酸分子互補的至少一個可連接的游離末端或區域，其中當探針結合所述分析物時，解折疊所述發夾結構允許所述至少第一和第二鄰位探針的核酸結構域直接或間接相互作用。

WO 2010/006291 A1提供了測定單細胞中多種蛋白的活化狀態的方法。該方法允許基于活化狀態、表達標志物和其他標準快速檢測復雜細胞群體中的異質性，以及鑒定在細胞群體內表現出相關激活變化的細胞亞群。此外，這種方法允許細胞活性或性質的相關性。另外，細胞激活調節劑的使用允許表征途徑和細胞群體。可以使用該方法分析的幾種示例性疾病包括AML、MDS和MPN。

發明概述

本發明的一個目的是提供一種用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法，其中所述方法解決或至少減少PLA的上述問題。

本發明提供了用于檢測對象樣品中蛋白的第一和第二表位或蛋白復合物的第一和第二蛋白的第一和第二表位的空間接近性的方法，其中所述方法包括：

-將具有與其綴合的第一寡核苷酸的第一結合構件結合到所述第一表位，

-將具有與其綴合的第二寡核苷酸的第二結合構件結合到所述第二表位，和

-確定在與第一寡核苷酸和第二寡核苷酸相締合的供體熒光團和受體熒光團之間是否存在熒光共振能量轉移（FRET）效應，其中FRET效應的存在指示第一和第二寡核苷酸的空間接近性以及，因此第一和第二表位的空間接近性，

其中所述第一寡核苷酸與所述第二寡核苷酸至少部分互補，

其中所述第一寡核苷酸最初提供有第一分離的屏蔽元件和/或所述第二寡核苷酸最初提供有用于防止所述第一和第二寡核苷酸過早雜交的第二分離的屏蔽元件。