[發(fā)明專利]用于監(jiān)測(cè)組織蛋白酶S抑制的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580050182.6
• 申請(qǐng)日: 2015-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN106715472A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·P·本托珀雷拉達(dá)席爾瓦;S·德茲阿德克;B·埃薩伯特;M·耶格;E·諾戈采克;M·馬爾齊諾夫斯基;B·雷斯;T·申德勒;M·A·E·西倫
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/28
• 分類號(hào): C07K16/28;C12Q1/37;G01N33/569;G01N33/573
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所11247
• 代理人: 凌立,黃革生

本發(fā)明提供抗li p10肽的抗體及其在用于監(jiān)測(cè)組織蛋白酶S抑制的方法中的用途。

組織蛋白酶S因其在蛋白水解消化不變鏈蛋白伴侶分子，從而控制抗原通過主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類分子呈遞給CD4⁺ T細(xì)胞或通過CD1分子呈遞給NK1.1+ T細(xì)胞中的重要功能而聞名。組織蛋白酶S似乎還參與通過MHC II類呈遞給CD4⁺ T細(xì)胞的外源抗原的直接加工，或參與通過MHC I類分子交叉呈遞給CD8⁺ T細(xì)胞。此外，組織蛋白酶S以其分泌形式涉及胞外基質(zhì)降解，這可促成許多疾病的病理，包括關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化和慢性阻塞性肺疾病。因此，對(duì)于開發(fā)用于多種適應(yīng)癥的新治療劑，組織蛋白酶S的抑制是有前景的靶標(biāo)。

MHC II類分子結(jié)合并展示抗原肽，作為抗原呈遞細(xì)胞(APC)的細(xì)胞表面上的由CD4⁺輔助細(xì)胞識(shí)別的II類-肽復(fù)合體。導(dǎo)致形成II類-肽復(fù)合體并在細(xì)胞表面呈遞抗原的分子機(jī)制始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的II類αβ異二聚體合成。在生物合成期間，這些αβ異二聚體與II型膜蛋白(不變鏈li的同種型)結(jié)合，形成αβli的九聚復(fù)合體。αβli復(fù)合體穿過高爾基體，遞送至胞內(nèi)區(qū)室。在這些酸性區(qū)室中，li被降解，并最終從αβli復(fù)合體釋放，允許II類分子結(jié)合抗原肽。li的蛋白水解加工產(chǎn)生更短的片段。在APC中，半胱氨酸蛋白酶組織蛋白酶S在加工li中發(fā)揮關(guān)鍵作用。組織蛋白酶S降解來自II類-li復(fù)合體的的不變鏈li，產(chǎn)生II類-CLIP。因此，組織蛋白酶S的抑制導(dǎo)致CLIP肽減少，前體片段(即不變鏈li降解肽p10(li p10))累積。

EP 1 315 966公開了用于監(jiān)測(cè)體內(nèi)施用組織蛋白酶S抑制劑的作用的方法。該方法包括從用組織蛋白酶S抑制劑處理的個(gè)體的血樣純化白細(xì)胞，制備所純化的白細(xì)胞的全細(xì)胞裂解物，并針對(duì)不變鏈li的li p10片段的存在分析全細(xì)胞裂解物。此方法需要約10-30ml血樣，且耗費(fèi)勞力(分離白細(xì)胞和制備全細(xì)胞裂解物)。li p10的檢測(cè)通過ELISA或Western印跡進(jìn)行。

本發(fā)明的目的是提供監(jiān)測(cè)組織蛋白酶S抑制的測(cè)定，該測(cè)定克服現(xiàn)有技術(shù)方法的至少一些缺點(diǎn)。

在第一目的中，本發(fā)明提供用于監(jiān)測(cè)動(dòng)物組織樣品中的組織蛋白酶S抑制劑活性的方法，其包括：

a)提供已對(duì)其施用組織蛋白酶S抑制劑的動(dòng)物的組織樣品，或提供在體外與組織蛋白酶S抑制劑接觸過的動(dòng)物組織樣品，其中組織樣品包含白細(xì)胞；

b)通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量步驟a)的組織樣品的白細(xì)胞中的li p10肽水平；和

c)使白細(xì)胞中的li p10肽水平與組織蛋白酶S抑制劑劑量關(guān)聯(lián)，其中組織蛋白酶S抑制劑導(dǎo)致白細(xì)胞中l(wèi)i p10肽水平提高。

在第二目的中，本發(fā)明提供用于鑒定組織蛋白酶S抑制劑的方法，其包括：

a)用測(cè)試化合物處理非人動(dòng)物；

b)提供步驟a)的動(dòng)物的包含白細(xì)胞的組織樣品；

c)測(cè)量步驟b)的組織樣品的白細(xì)胞中的li p10肽水平；

其中與未經(jīng)處理的動(dòng)物的組織樣品中的白細(xì)胞中l(wèi)i p10肽的水平相比，步驟a)的樣品中的白細(xì)胞中l(wèi)i p10肽水平的提高指示組織蛋白酶S抑制劑。

在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，該組織樣品是血液。

在本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該白細(xì)胞是抗原呈遞細(xì)胞(APC)，優(yōu)選地，該APC選自B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，更優(yōu)選選自B細(xì)胞和單核細(xì)胞。

本文所用的術(shù)語抗原呈遞細(xì)胞(APC)指將抗原肽作為(MHC)II類-抗原肽復(fù)合體展示在其表面的細(xì)胞。APC包括樹突細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞。

在第三目的中，本發(fā)明提供抗li p10抗體，其包含：

包含含有氨基酸序列Seq.Id.No.4的CDR1、含有氨基酸序列Seq.Id.No.5的CDR2、含有氨基酸序列Seq.Id.No.6的CDR3的VH結(jié)構(gòu)域，及包含含有氨基酸序列Seq.Id.No.7的CDR1、含有氨基酸序列Seq.Id.No.8的CDR2、含有氨基酸序列Seq.Id.No.9的CDR3的VL結(jié)構(gòu)域。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，抗li p10抗體的VH結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列Seq.Id.No.10，抗li p10抗體的VL結(jié)構(gòu)域包含氨基酸序列Seq.Id.No.11.