[發(fā)明專利]糖底物的酶促轉(zhuǎn)磷酸化

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580048580.4
• 申請(qǐng)日: 2015-06-30
• 公開（公告）號(hào): CN106715705A
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: V·納維茨卡斯;K-U·鮑爾代紐斯;M·布羅伊爾;P·維爾德貝格爾;M·普法伊費(fèi)爾;B·尼德茨
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號(hào): C12P19/26
• 分類號(hào): C12P19/26;C12P19/02;C07H1/02;C07H11/04
• 代理公司: 北京市中咨律師事務(wù)所11247
• 代理人: 胡晨曦,黃革生

本發(fā)明涉及通過酶促轉(zhuǎn)磷酸化制備糖磷酸酯的方法，其中磷酰基從磷酸供體底物轉(zhuǎn)移到糖底物是由具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶催化。在另一方面，本發(fā)明涉及具有蔗糖磷酸化酶以及α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的生物催化劑及其用途。根據(jù)另一方面，本發(fā)明還涉及具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶的制備及其在糖底物的轉(zhuǎn)磷酸化中的用途。

糖底物的磷酸化是對(duì)細(xì)胞代謝至關(guān)重要的常見生化轉(zhuǎn)化(1-3)。其通常涉及磷酰基從磷酸化活化的供體底物(例如ATP)轉(zhuǎn)移至糖主鏈上的受體基團(tuán)(4-7)，通常為羥基。各種磷酸轉(zhuǎn)移酶催化糖的磷酸化(8-12)。在由糖苷磷酸化酶催化的備選反應(yīng)中，其中磷酸化僅在糖的異頭位置發(fā)生，糖基殘基從糖供體底物轉(zhuǎn)移至磷酸鹽(圖1A)(13-14)。與糖連接的磷酸酯部分是生物識(shí)別的關(guān)鍵要素，例如整個(gè)糖酵解的所有步驟，并且其用于引導(dǎo)糖在不同生物化學(xué)途徑中進(jìn)一步轉(zhuǎn)化(15-18)。從細(xì)胞內(nèi)代謝物分析研究中已知，常見的糖磷酸酯(例如D-葡萄糖-6-磷酸酯，Glc-6-P；D-果糖-6-磷酸酯，F(xiàn)ru-6-P)的濃度變化通常與細(xì)胞生理的主要改變相關(guān)(19-22)。由于在不同生物學(xué)研究中對(duì)可靠的參考材料的需求，對(duì)糖磷酸酯的合成制備(20)有相當(dāng)大的興趣。技術(shù)上來說，糖磷酸酯作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和增味劑應(yīng)用于食品和飼料產(chǎn)品；作為化妝品中的保濕成分；作為洗滌劑中的離子型表面活性劑；以及作為新聚合物的結(jié)構(gòu)單元(23-25)。

已經(jīng)成功開發(fā)了天然已知的磷酸化反應(yīng)，用于糖磷酸酯的生物催化合成。糖基轉(zhuǎn)移至磷酸酯基本上限于應(yīng)用在己糖-1-磷酸酯產(chǎn)物，并且糖苷磷酸化酶反應(yīng)的相對(duì)較窄的底物范圍限制一個(gè)至僅幾個(gè)糖基磷酸酯，其已在制備規(guī)模上證明能有效生產(chǎn)(例如α和β-Glc-1-P(26,27)，α-D-半乳糖-1-磷酸酯(28))。相反，磷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)提供了方便獲得多種糖磷酸酯產(chǎn)物的途徑，如多種己糖底物通過例如糖激酶的核苷三磷酸依賴性磷酸化所示(29-33)。然而，磷酸化活化的供體底物的高成本和由所得的脫磷酸化產(chǎn)物(例如來自ATP的ADP)引起的酶抑制需要磷酰基供體僅以催化量提供，并因此在反應(yīng)期間被連續(xù)再生(圖1B)(34,35)。這使得生物催化的磷酰基轉(zhuǎn)移成為技術(shù)上復(fù)雜的整體轉(zhuǎn)化，目前在糖磷酸酯合成中使用有限。

在其天然的磷酸單酯水解反應(yīng)的改變中，磷酸酶催化的轉(zhuǎn)磷酸化被認(rèn)為是糖磷酸酯的替代途徑(圖1C)(36-39)。在糖以足以有效地超出與水反應(yīng)的濃度存在的條件下，一些磷酸酶(例如酸性磷酸酶)以中等(例如D-甘露糖-6-磷酸酯；15％)至優(yōu)良的產(chǎn)率(例如Glc-6-P；高達(dá)95％)(37)促進(jìn)糖磷酸酯的形成。使用合適的磷酰基供體底物例如無機(jī)焦磷酸鹽或寡磷酸鹽是有利的。然而，供體底物水解的高度優(yōu)勢(shì)、糖磷酸酯產(chǎn)物的快速二次水解以及所釋放的磷酸的組合抑制和質(zhì)量作用效應(yīng)(圖1C)是磷酸酶催化合成的關(guān)鍵問題(40,41)。因此，仍然需要確認(rèn)具有改善的合成效力的轉(zhuǎn)磷酸化系統(tǒng)。

本發(fā)明的目的是提供用于以高產(chǎn)率有效生產(chǎn)糖磷酸酯的系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明的目的是提供用于從多種磷酸供體底物向糖底物的酶促磷酰基轉(zhuǎn)移的方法和材料。

本發(fā)明的發(fā)明人能夠證明，具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶能夠有效地催化多種磷酸供體和糖底物之間的轉(zhuǎn)磷酸化反應(yīng)，因此是用于靈活的生成糖磷酸酯的非常有效的工具。

因此，上述的本發(fā)明的目的通過以下方法來實(shí)現(xiàn)：一種通過酶促轉(zhuǎn)磷酸化制備一種或多種糖磷酸酯的方法，所述方法包括以下步驟：

(i)提供一種或多種糖底物，

(ii)提供一種或多種磷酸供體底物，

(iii)提供α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶，

(iv)將步驟(i)中提供的一種或多種糖底物和步驟(ii)中提供的一種或多種磷酸供體底物與步驟(iii)中提供的α-葡萄糖-1-磷酸酶或具有α-葡萄糖-1-磷酸酶活性的酶在允許轉(zhuǎn)磷酸化的條件下一起溫育，

(v)任選地，純化在步驟(iv)中獲得的一種或多種糖磷酸酯。

在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語轉(zhuǎn)磷酸化是指一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)從供體底物向受體底物的轉(zhuǎn)移。

在本發(fā)明的上下文中，底物可以是能夠在一個(gè)或多個(gè)位置提供或接受一個(gè)或多個(gè)磷酸基團(tuán)的任何分子。特別地，本發(fā)明上下文中的底物是磷酸化或未磷酸化的碳水化合物，例如醛糖或酮糖。