[發明專利]利用單管添加方案的加標簽的核酸的文庫制備

有效

• 申請號: 201580046283.6
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN106795651B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: F·凱珀;戈登·卡恩
• 申請（專利權）人: 伊魯米那股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 李平;鄭霞

一種制備加標簽的核酸片段的文庫的方法，所述方法包括：使細胞群體與具有一種或更多種蛋白酶的裂解試劑直接接觸，以生成細胞裂解物；使蛋白酶失活，以生成失活的細胞裂解物，和在其中靶核酸和轉座子末端成分經歷轉座反應的條件下，將轉座酶和包含轉移鏈的轉座子末端成分應用至失活的細胞裂解物。

技術領域

本公開內容大體涉及用于制備核酸片段的文庫的方法，且更特別地涉及用于在單管中利用蛋白酶制備核酸片段的文庫用于多種應用包括例如下一代DNA測序的方法。

背景技術

存在這樣的多種方法和應用，對于其來說，期望生成片段化并加標簽的核酸的文庫，例如用作DNA測序的模板和/或用于分析拷貝數變異。

最近開發的“下一代”DNA測序技術，諸如由Illumina,Inc.(San Diego,CA)開發的那些“下一代”DNA測序技術，利用大規模并行或多重格式使能夠在單個序列運行中從數百萬個測序模板生成序列數據。“下一代”測序的該大規模并行性質要求生成包含來自靶核酸樣品例如基因組DNA的核酸片段的集合或群體的核酸片段文庫。更重要地，它要求這些核酸片段的組合展現出為來自靶核酸樣品的序列的定性和/或定量代表的序列。當核酸樣品來自細胞時，目前的用于生成核酸片段的文庫的方法通常要求分離步驟，用于在核酸片段化之前將靶核酸從細胞分離。該核酸提取步驟通常浪費靶核酸樣品，并且通常致使制備的核酸不能定性地代表來自樣品的靶核酸。當樣品的量有限或難以獲得時，這成為特別嚴重的問題。為了解決該問題，目前的一些方法在片段化之前使用核酸擴增。但是，擴增無法確保靶核酸的代表性，因為靶核酸在擴增之前的提取期間仍部分地丟失。

因此，對能夠快速并有效地制備核酸片段文庫的新方法存在需求。本公開內容通過提供用于利用蛋白酶在單個反應混合物中例如在單個管中制備核酸片段的文庫的方法，解決了該需求。還提供了相關優勢。

發明內容

在一個方面，本文提供了制備加標簽的核酸片段的文庫的方法，所述方法包括：(a)使細胞群體直接與裂解試劑接觸，以生成細胞裂解物，其中裂解試劑具有一種或更多種蛋白酶，并且其中細胞裂解物包含靶核酸；(b)使一種或更多種蛋白酶失活，以形式失活的細胞裂解物，和(c)在其中靶核酸和轉座子末端成分經歷轉座反應以生成混合體(mixture)的條件下，將至少一種轉座酶和包含轉移鏈的至少一種轉座子末端成分直接應用于失活的細胞裂解物，其中(i)靶核酸被片段化以生成多個靶核酸片段，并且(ii)轉座子末端成分的轉移鏈被連接至多個靶核酸片段的每一個的5'末端，以生成多個5'加標簽的靶核酸片段。

在一些實施方案中，本文提供的步驟(a)、(b)和(c)在單個反應混合物中例如在一個管中進行。在一些實施方案中，細胞群體為細胞的最小群體。在一些實施方案中，細胞的最小群體包含一個、兩個、三個、四個或五個細胞。

在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶選自由以下組成的組：絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶及其變體。在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶在細胞裂解物中的濃度為0.1mg/ml至10mg/ml。在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶在細胞裂解物中的濃度為0.1mg/ml至2.5mg/ml。在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶在細胞裂解物中的濃度為0.5mg/ml。在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶在細胞裂解物中的濃度為4.5mAU/ml至500mAU/ml。在一些實施方案中，一種或更多種蛋白酶在細胞裂解物中的濃度為22.5mAU/ml。

在一些實施方案中，在步驟(a)中細胞群體在pH 7.0至pH 10.0與裂解試劑接觸。在一些實施方案中，細胞群體在pH 7.0至pH 9.0與裂解試劑接觸。