[發(fā)明專利]利用單管添加方案的加標簽的核酸的文庫制備

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580046283.6
• 申請日: 2015-06-25
• 公開（公告）號: CN106795651B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設計）人: F·凱珀;戈登·卡恩
• 申請（專利權）人: 伊魯米那股份有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 李平;鄭霞

1.一種制備加標簽的核酸片段的文庫的方法，所述方法包括：

(a)使單個細胞與裂解試劑直接接觸，以生成細胞裂解物，其中所述裂解試劑具有一種或更多種蛋白酶，并且其中所述細胞裂解物包含靶核酸；

(b)使所述一種或更多種蛋白酶失活，以形成失活的細胞裂解物，以及

(c)在其中所述靶核酸和轉座子末端成分經(jīng)歷轉座反應以生成混合體的條件下，將至少一種轉座酶和包含轉移鏈的至少一種轉座子末端成分直接應用至所述失活的細胞裂解物，其中：

(i)所述靶核酸被片段化，以生成多個靶核酸片段，

(ii)所述轉座子末端成分的轉移鏈被連接至多個所述靶核酸片段的每一個的5'末端，以生成多個5'加標簽的靶核酸片段，

(iii)所述靶核酸是雙鏈DNA，并且

(iv)所述靶核酸在步驟(c)中應用轉座酶和轉座子末端成分之前依然是所述雙鏈DNA。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)在單個反應管中進行。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞群體為最小細胞群體，并且其中所述最小細胞群體包含一個、兩個、三個、四個或五個細胞。

4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或更多種蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶及其變體。

5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述細胞裂解物中所述一種或更多種蛋白酶的濃度為4.5mAU/ml至500mAU/ml。

6.根據(jù)權利要求5所述的方法，其中所述細胞裂解物中所述一種或更多種蛋白酶的濃度為22.5mAU/ml。

7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)中所述細胞群體在pH 7.0至pH 10.0與所述裂解試劑接觸。

8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述細胞群體在pH 7.0至pH 9.0與所述裂解試劑接觸。

9.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在步驟(b)中所述一種或更多種蛋白酶通過增加溫度失活。

10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其中所述一種或更多種蛋白酶通過增加溫度至50℃-80℃失活。

11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中所述一種或更多種蛋白酶通過增加溫度至70℃失活。

12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述一種或更多種蛋白酶通過添加所述一種或更多種蛋白酶的一種或更多種抑制劑失活。

13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述裂解試劑包含一種或更多種去垢劑。

14.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述一種或更多種去垢劑為非離子型去垢劑。

15.根據(jù)權利要求13所述的方法，其中所述一種或更多種去垢劑包括Triton。

16.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中在步驟(a)和(c)之間沒有在前的DNA純化或擴增步驟。

17.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸為基因組DNA。

18.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含染色體DNA或其片段。

19.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包括基因組或部分基因組。

20.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述至少一種轉座酶為Tn5轉座酶。