[發明專利]修飾型β-半乳糖苷酶

有效

• 申請號: 201580044502.7
• 申請日: 2015-08-13
• 公開（公告）號: CN106604991B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發明（設計）人: 石川一彥;石原聰;山口莊太郎
• 申請（專利權）人: 天野酶株式會社
• 主分類號: C12N9/38
• 分類號: C12N9/38;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N15/09;C12P19/04
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 苗堃;金世煜

技術領域

本發明涉及β-半乳糖苷酶。詳細而言，涉及來自環狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶的修飾以及修飾型酶的用途等。本申請基于2014年8月19日申請的日本專利申請第2014-166897號要求優先權，參照并引用該專利申請的全部內容。

背景技術

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)是水解β-D-半乳糖苷鍵使D-半乳糖游離的酶，一般廣泛存在于微生物和動植物中。β-半乳糖苷酶別名被稱為乳糖酶。另外，β-半乳糖苷酶還具有使半乳糖苷鍵轉移的能力，已知有利用該能力制造低聚半乳糖(具有半乳糖殘基的低聚糖)的方法。

已知米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、馬克斯克魯維酵母(K.marxinus)、細菌環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)等產生β-半乳糖苷酶。其中，來自環狀芽孢桿菌的β-半乳糖苷酶(專利文獻1，非專利文獻1)是能夠用乳糖生成低聚半乳糖的酶，是工業上制造低聚半乳糖的重要的酶(例如，以“BIOLACTA”的商品名銷售β-半乳糖苷酶制劑)。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：國際公開第2010/140435號小冊子

非專利文獻

非專利文獻1：Song，J.，Abe，K.，Imanaka，H.，Imamura，K.，Minoda，M.，Yamaguchi，S.，&Nakanishi，K.(2010).Causes of the production of multiple forms of β-galactosidase by Bacillus circulans.Bioscience，biotechnology，and biochemistry，75(2)，268-278.

發明內容

就低聚糖的制造而言，向底物糖類(乳糖等)添加酶后，通常加熱進行。在該酶反應中，為了提高底物的溶解度、防止雜菌的污染等，優選反應溫度盡可能的高。已知利用酶的轉糖基作用通常底物濃度越高效率越好地進行。另外，高溫的情形由于底物的溶解度高，所以能夠提高底物濃度。因此，工業生產中特別期望酶的耐熱性的提高。另一方面，報告了利用酶工程技術等進行酶的修飾時酶的穩定性降低。雖然酶的性質被改良，但是酶的穩定性(耐熱性等)受到影響，也存在不能實現實用化的情形。在這樣的情形中，進一步施加修飾，如果能夠提高酶的穩定性，會向實用化大大前進。

因此本發明的課題在于提供低聚糖的制造等中有用的提高β-半乳糖苷酶的耐熱性的技術、其產物以及用途等。

根據目前的研究，得知環狀芽孢桿菌生產的β-半乳糖苷酶由分子量不同的4種酶，即，分子量195kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-A，序列號1)、分子量160kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-B，序列號2)、分子量135kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-C，序列號3)、和分子量86kD的β-半乳糖苷酶(BgaD-D，序列號4)構成。其中BgaD-D是具有酶活性的最小尺寸的β-半乳糖苷酶，轉糖基活性最高。由于該特性，BgaD-D在低聚糖的制造中特別有用。關注這一點，嘗試確定BgaD-D的立體結構。具體而言，采用使用0.4M檸檬酸三鈉鹽二水合物(sodium citrate tribasic dihydrate)、1.0M三水合醋酸鈉(sodium acetate trihydrate)(pH4.0)、25％w/v聚乙二醇(Polyethylene glycol)3350作為沉淀劑的懸滴式液蒸汽擴散法，使用精制成高純度的BgaD-D以結晶化為目標。需要約1年的時間，但是不均勻溶液的界面附近僅成功發現3個結晶。從其中選擇結晶，嘗試裝入結晶結構解析用裝置。其結果，1個結晶中，成功收集其反射數據。因此，使用本數據，利用相位決定軟件進行約2周的計算。其結果，幸運地成功確定BgaD-D的立體結構。接下來，在立體結構信息的基礎上確定預計對耐熱化有效的氨基酸，導入突變。詳細研究各突變體的特性的結果，3個突變點對耐熱化有效。進一步的研究結果表明通過組合有效的突變，耐熱性進一步提高。下述的發明主要基于以上的成果以及考察。