[發明專利]通過數字化轉座子的單倍體組測定

有效

• 申請號: 201580040110.3
• 申請日: 2015-05-21
• 公開（公告）號: CN107075509B
• 公開（公告）日: 2021-03-09
• 發明（設計）人: 奚雷;汪小輝;馬克·恩格;大衛·魯夫
• 申請（專利權）人: 數字基因公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 鄭霞

在某些實施方案中，本發明提供了在進一步分析之前通過使用轉座酶將差異條形編碼的轉座子插入基因組DNA中而“數字化地”標記不同染色體的不同等位基因的方式。根據該方法，每個等位基因變得標記有獨特的轉座子條形碼模式。由于每種獨特的轉座子條形碼模式標識出特定的等位基因，因此該方法有利于確定倍性和拷貝數變異，提高辨別純合子、雜合子和由測序錯誤產生的模式的能力，并允許將由不提供信息的DNA段隔開的基因座鑒別為連鎖基因座，從而有利于單倍型確定。還提供了一種新的人工轉座子末端，其包括在兩個或更多個位置的條形碼序列，這些位置對于轉座不是必需的。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2014年5月23日提交的第62/002,733號美國臨時申請的權益，該臨時申請通過引用整體并入本文。

關于對聯邦資助的研究與開發下作出的發明享有權利的聲明

不適用。

技術領域

本發明總體上涉及利用轉座子確定單倍體組(haploidome)的領域。在特定的實施方案中，本發明涉及利用數字化的轉座子由單細胞高分辨率地確定完整單倍體組的方法和組合物。

背景技術

已經充分證明，通過基于PCR的擴增或通過等溫擴增進行的全基因組擴增通常導致有偏差的擴增，從而致使一些區域擴增過度，而另一些區域擴增不足。這種偏差使得拷貝數變異(CNV)難以確定，并且使單核苷酸多態性(SNP)或單核苷酸變異(SNV；即突變)的鑒定或“判定”具有挑戰性。

已經采用多種計算機程序來幫助解決這些問題。然而，由于擴增的無序性，常常難以確定觀察到的CNV是真實的還是擴增的假象。此外，大多數計算機程序基于每個基因組由44條常染色體和兩條性染色體組成的假設而運行，但并非所有細胞均如此，而且對于癌細胞來說肯定不是這樣，癌細胞可在癌細胞系內和癌組織內的細胞之間在拷貝數方面表現出巨大差異。

具體而言，核型分析研究已發現，一些正常的哺乳動物細胞具有高倍性。單細胞可含有4、6、8條或多達數百條全套染色體。這些細胞在整個基因組中具有一致的拷貝數變化。因此，利用常規測序方法或PCR無法確定這些細胞的絕對拷貝數，原因在于這些方法全部依賴于染色體上的至少一個參考點，該參考點可能是基因或區段或整個染色體。

腫瘤組織中或已確立的腫瘤細胞系中的腫瘤細胞的核型傾向于甚至更加復雜且不均勻。染色體數目常常從少于46條(亞倍體)至92條(四倍體)不等。在已確立的腫瘤細胞系內或腫瘤組織內的腫瘤細胞由具有不同染色體數目的細胞集合組成，并且特定染色體，例如染色體1，可在一個細胞中以1個拷貝，或2個拷貝，或5個拷貝，或6個拷貝，或7個拷貝存在，但在另一個細胞中可能缺失，這都增加了復雜性。因此，對于此類腫瘤細胞系，染色體1的平均拷貝數可以為分數。因為七個染色體1之一上的一個突變將由14％的讀序(reads)來表示，所以對于類似于此的情況，突變“判定”極具挑戰性。

此外，在癌癥研究中的罕見突變檢測中，即使在“深度測序”的幫助下，測序中約1％的典型錯誤率也常常導致數以億計的測序錯誤。這些分散的錯誤在一些應用中可以被容忍，但如果在次要等位基因中出現罕見突變，則在鑒定細胞群體以及單細胞中的超罕見突變時會變得非常成問題。

發明內容

在各個方面，本文預期的發明可包括但不必限于以下實施方案中的任一個或多個：

實施方案1：一種試劑盒，其包含一組兩個或更多個轉座子，其中每個轉座子包含不同的第一轉座子條形碼序列和位于填充序列側翼的轉座子末端，其中所述轉座子各自在所述填充序列中包含相同的第一引物結合位點并且能夠被轉座酶插入核酸中。

實施方案2：根據實施方案1所述的試劑盒，其中所述第一轉座子條形碼序列位于轉座子末端內或鄰近轉座子末端。