[發(fā)明專利]雙順反子細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580037078.3
• 申請日: 2015-07-09
• 公開（公告）號: CN106661588B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 沙爾頓爾·薩盧西;布拉杰什·瓦爾什尼;薩德希巴布·索拉帕內(nèi)尼
• 申請（專利權(quán)）人: 魯平有限公司
• 主分類號: C12N15/67
• 分類號: C12N15/67;C12N15/70;C12P21/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 宋融冰

本發(fā)明涉及在單一載體中的雙獨立順反子表達(dá)系統(tǒng)，其用于在細(xì)菌大腸桿菌中產(chǎn)生表達(dá)為形成的不溶性包涵體的目的蛋白質(zhì)和肽的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還提供了用于使用所述雙順反子載體表達(dá)目的蛋白質(zhì)的方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的單一載體中的雙獨立順反子表達(dá)系統(tǒng)，所述目的蛋白質(zhì)包含表達(dá)為在細(xì)菌大腸桿菌(E.coli.)中形成的不溶性包涵體的抗體的重組Fab片段或其它抗體片段、肽和蛋白質(zhì)。

背景技術(shù)

重組DNA技術(shù)(rDNA)已經(jīng)徹底改變了治療劑的制備方式。所需蛋白質(zhì)現(xiàn)在在外源細(xì)胞內(nèi)制備并純化。

具有翻譯后修飾(PTM)的蛋白質(zhì)通常在哺乳動物或酵母系統(tǒng)中表達(dá)為重組分子。酵母表達(dá)系統(tǒng)如畢赤酵母屬(Pichia)和酵母屬(Saccharomyces)在PTM方面更接近哺乳動物系統(tǒng)，但是在糖基化類型中依然不同，如在畢赤酵母屬情況下的高甘露糖聚糖，使得其不適合用于人使用的重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。

單克隆抗體(mAb)、抗體、融合蛋白、mAb的Fab片段被用作治療劑。rDNA技術(shù)使用專門的載體和表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)。表達(dá)系統(tǒng)主要由細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)組成。最初，大多數(shù)重組蛋白質(zhì)在使用大腸桿菌作為宿主的細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。使用大腸桿菌作為表達(dá)宿主具有多個優(yōu)點，例如容易克隆、容易表達(dá)、更短的時間表、更短的孵育期和非常高的產(chǎn)量。因此，可以在大腸桿菌中安全地表達(dá)不需要任何PTM的蛋白質(zhì)。

作為mAb的抗原結(jié)合片段部分的Fab不需要在哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)，因為其不包含存在于抗體Fc部分中的糖基化位點。因此，F(xiàn)ab通常在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)。在1980-1990期間，數(shù)位研究人員嘗試了在大腸桿菌中表達(dá)Fab。PlückthunA等人,1990BehringInst.Mitt.(87):48-55是報道了從大腸桿菌中分泌Fab抗體的一些早期工作人員。Williamson R.A.等人,1991Biochem J.277(Pt 2):561-3報道了使用噬菌體λ載體在大腸桿菌中表達(dá)Fab分子。用于在大腸桿菌中生產(chǎn)Fab、二價抗體或嵌合抗體片段的噬菌體展示系統(tǒng)。此外，F(xiàn)ab也在大腸桿菌中作為錯誤折疊的包涵體產(chǎn)生，然后將其重折疊以獲得功能分子，從而獲得抗體產(chǎn)率40％的提高。

上述大多數(shù)研究使用單啟動子(即phoA)來驅(qū)動重鏈和輕鏈兩者的表達(dá)。存在于重鏈和輕鏈之間的核糖體結(jié)合位點(rbs)驅(qū)動第二基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。

US5648237也采用類似的單啟動子(phoA)策略來在大腸桿菌中表達(dá)Fab基因，以獲得分泌產(chǎn)物。上述策略的主要缺點是第二基因的表達(dá)水平通常低于第一基因，因此限制功能性Fab的產(chǎn)量。

專利No.WO03018771公開了通過兩個分開的翻譯單元產(chǎn)生抗體的方法，所述翻譯單元分別編碼所述抗體或片段的輕鏈和重鏈，其中兩條鏈以順序方式表達(dá)，從而特異性地分離輕鏈和重鏈的產(chǎn)生，并允許輕鏈和重鏈組裝。

專利No.EP1356052B1公開了在原核細(xì)胞中產(chǎn)生全抗體的方法。存在第一啟動子和第一順反子以產(chǎn)生免疫球蛋白輕鏈，以及第二啟動子和第二順反子以產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈，其中兩條鏈折疊并組裝以形成生物活性免疫球蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

在一個實施方案中，本發(fā)明涉及單一載體中的雙獨立順反子表達(dá)系統(tǒng)，其用于在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)為不溶性包涵體的重組蛋白質(zhì)和肽。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及制備具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達(dá)系統(tǒng)的方法，其用于在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)為不溶性包涵體的重組蛋白質(zhì)和肽。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達(dá)系統(tǒng)，其用于在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)為不溶性包涵體的抗體片段。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有兩個不同啟動子的單一載體中的雙獨立順反子表達(dá)系統(tǒng)，其用于在細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生表達(dá)為不溶性包涵體的抗體的重組Fab片段。