[發明專利]針對絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf(BRAF)的SRM/MRM測定

有效

• 申請號: 201580035587.2
• 申請日: 2015-07-13
• 公開（公告）號: CN106796238B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 大衛·B·克里茨曼;托德·哈姆布拉夫;史諾·塞帕洛姆比爾;遼衛禮
• 申請（專利權）人: 愛科譜迅病理研究公司
• 主分類號: G01N33/66
• 分類號: G01N33/66
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 劉依云;喬雪微

本發明提供了來自絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B?raf(BRAF)的具體的肽和這些肽的衍生電離特性，其特別有利于通過選擇反應監測(SRM)質譜或也可稱作多反應監測(MRM)質譜的方法直接定量已經在福爾馬林中固定的生物樣品中的BRAF蛋白質。這類生物樣品是經化學保藏和固定的，該生物樣品選自使用含有試劑/固定劑的甲醛處理的組織和細胞，包括福爾馬林固定的組織/細胞、福爾馬林固定/石蠟包埋(FFPE)的組織/細胞、FFPE組織塊和來自那些塊的細胞，以及經福爾馬林固定和或石蠟包埋的組織培養細胞。使用Liquid Tissue試劑和方案從該生物樣品中制備蛋白質樣品并通過在蛋白質樣品中定量至少一種或多種所描述的肽來使用SRM/MRM質譜的方法在Liquid Tissue樣品中定量BRAF蛋白質。這些肽在其以修飾的或未修飾的形式存在時可被定量。BRAF肽的修飾的形式的一個示例是肽序列內酪氨酸、蘇氨酸、絲氨酸和/或其他氨基酸殘基的磷酸化。

本申請要求2014年7月11日提交的臨時申請序列號62/023,615的優先權，其內容通過引用全文納入本文。

引言

提供了來源于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B-raf(其也稱作原癌基因B-Raf、p94、v-Raf鼠肉瘤病毒癌基因同系物B1和BRAF，并在本文中稱作“BRAF”)的亞序列的特定肽。各種肽的肽序列和碎片/過渡離子可用于基于質譜的選擇性反應監測(SRM)測定中，其也稱為多反應監測(MRM)測定，且在本文中稱作SRM/MRM。描述了用于BRAF蛋白質的SRM/MRM定量分析的肽的用途。

可使用該SRM/MRM測定來測量來自BRAF蛋白質的一種或多種特異性肽的相對或絕對定量水平，并由此提供通過質譜測量在從生物樣品中獲得的給定蛋白質制備物中BRAF蛋白質的總量的方法。

更具體地，該SRM/MRM測定可直接測量由從諸如福爾馬林固定的癌癥患者組織的患者組織樣品取得的細胞制備的復雜蛋白質裂解物樣品中的那些肽。由福爾馬林固定的組織制備蛋白質樣品的方法描述在美國專利第7,473,532號中，其內容通過引用全文納入本文。該專利描述的方法可使用獲自表達病理學公司(Expression Pathology Inc.)(馬里蘭州羅克維爾)的Liquid試劑和方案方便地進行。

可最廣泛且有利地獲得的來自癌癥患者組織的組織形式是福爾馬林固定、石蠟包埋的組織。對手術移出的組織進行甲醛/福爾馬林固定是迄今為止世界范圍內最常見的保存癌癥組織樣品的方法且是標準病理學實踐中已經接受的常規方法。甲醛水溶液被稱作福爾馬林。“100％”福爾馬林由甲醛在水中的飽和溶液(約40體積％或37重量％)組成，其含有少量用于限制氧化和聚合程度的穩定劑，通常為甲醇。保藏組織的最常用方式是將整個組織在通常稱為10％中性緩沖福爾馬林的甲醛水溶液中長時間(8小時至48小時)浸泡，接著在室溫下將固定的整個組織包埋在石蠟中以便長期儲存。因此，分析福爾馬林固定的癌癥組織的分子分析方法將是用于分析癌癥患者組織的最被接受且大量利用的方法。

SRM/MRM測定的結果可用于關聯自其中收集并保藏組織(生物樣品)的患者或受試者的具體組織樣品(例如癌癥組織樣品)內BRAF蛋白質的準確且精確的定量水平。這不僅提供關于癌癥的診斷和預后信息，而且容許醫師或其它醫療專業人員更精確地確定用于患者的適當療法。提供關于患病組織或其他患者樣品中蛋白質表達水平的診斷、預后和治療重要信息的這一測定稱為伴隨診斷測定。例如，這一測定可設計用于診斷癌癥的階段或程度并確定患者最可能應答的治療劑。

發明內容

本發明所述的測定測量來自BRAF蛋白質的特定未修飾的肽的相對或絕對水平并且可測量來自BRAF蛋白質的特定修飾的肽的絕對或相對水平。修飾的示例包括可能在這些肽上存在的磷酸化氨基酸殘基和糖基化氨基酸殘基。