[發明專利]層析方法

在審

• 申請號: 201580034231.7
• 申請日: 2015-06-04
• 公開（公告）號: CN106795215A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: J-L.馬洛伊塞;O.林德;B.諾倫;R.帕姆格倫
• 申請（專利權）人: 通用電氣醫療集團生物工藝研發股份公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K1/22
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 徐晶,楊思捷

發明領域

本發明涉及一種層析方法。更接近地，本發明涉及一種在用于純化目標分子優選單克隆抗體mAbs的層析方法中除去大的污染物（例如病毒）的方法，通過使用具有薄的外層和用吸收所述mAbs或其部分的配體官能化的核的專門設計的層析珠。

發明背景

免疫球蛋白代表在世界范圍內制造或開發中的最流行的生物藥物產品。對該特別治療市場的高商業要求和由此產生的價值導致重點被放在藥物公司上以在控制相關成本的同時使其相應的mAb制造方法的生產率最大化。

在大多數情況下，親和層析用作在純化這些免疫球蛋白分子例如單克隆或多克隆抗體中的關鍵步驟之一。特別感興趣種類的親和試劑為能夠特異結合到免疫球蛋白分子的不變部分的蛋白質，這種相互作用獨立于抗體的抗原-結合特異性。這種試劑可以廣泛用于從不同樣品（例如但不限于血清或血漿制劑或細胞培養物衍生的原料）親和層析回收免疫球蛋白。這種蛋白質的例子為包含能夠結合到來自不同物類的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的域的葡萄球菌蛋白質A。

由于其高親和性和選擇性，發現基于葡萄球菌蛋白質A (SpA)的試劑在生物技術領域中（例如在用于捕獲和純化抗體以及用于檢測的親和層析中）廣泛使用。當前，基于SpA的親和介質可能為最廣泛使用的親和介質，其用于從不同樣品（包括來自細胞培養物的工業原料）分離單克隆抗體及其片段。因此，包含蛋白質A-配體的各種基質為市售可得的，例如為天然蛋白質A形式（例如蛋白質A SEPHAROSE?，GE Healthcare，Uppsala，Swenden）且還由重組蛋白質A（例如rProtein A SEPHAROSE?，GE Healthcare）構成。更特別地，在商業重組蛋白質A產品中實施的基因操作的目的在于促進其附接到載體。

病毒除去為在mAbs的下游純化中的必要純化步驟。病毒除去通過使mAb進料流過具有限定截流的專用病毒除去過濾器常規地實施，因此mAb經過過濾器而病毒的主要部分無法通過。

不管在免疫球蛋白生產期間的病毒除去的現有技術，仍然需要改進的產品和方法。

發明概述

第一方面，本發明涉及用于從較大污染物例如病毒純化含免疫球蛋白蛋白質或其部分的方法，其包括：a）使含免疫球蛋白樣品與包含具有限定的孔尺寸的薄蓋(lid)和提供有親和配體的限定的孔尺寸的內核的層析珠接觸；b）將所述含免疫球蛋白蛋白質吸收到所述配體；c）清洗所述珠以除去任何污染物；和d）洗脫所述珠以釋放捕獲的含免疫球蛋白蛋白質或其部分。

所述層析珠的平均直徑尺寸為10-500μm，例如10-50μm，50-100μm或250-450μm。所述層析珠可以例如用于精加工、捕獲且在細胞培養物之后的中游使用。

根據例如高離析度或快速傳質所需的具體應用，或當進料粘度高時，選擇所述層析珠的尺寸。所述層析介質的平均尺寸例如計算為體積加權的中值直徑。

所述蓋的厚度為1-8μm，優選3-5μm。所述蓋厚度可以根據全部珠尺寸有利地變化。例如，在一些實施方案中，具有較薄蓋以便保持高的結合容量是合乎需要的。在其他實施方案中，當病毒對數降低比結合容量更重要時，設計具有較厚蓋的層析介質為有利的。

當mAb或Fab為目標時，所述蓋優選為無活性的，即不提供有任何相互作用的配體。所述蓋厚度可以通過共焦顯微鏡，通過切片機切片或常規顯微鏡測量。

所述蓋和核的孔尺寸對應于0.1-1的K_D，優選0.3-0.7，其用Mw 110 kDa的葡聚糖作為探針分子測量。本發明適用于大于20000D的目標分子，例如約150000D的Mab。所述孔尺寸對容量而且對選擇性具有重要性。在溶脹材料例如瓊脂糖和其他多糖凝膠中，所述孔尺寸最好通過反向排阻層析方法評估，其中測定探針分子（例如Mw 110 kDa的葡聚糖）可通過的體積分數K_d。在例如L Hagel等人:J Chromatogr A 743，33-42(1996)中描述了這種方法。

所述蓋和核的孔尺寸可以為相同的或不同的。對于Mabs和Fabs的純化，優選為相同的。

在優選的實施方案中，所述蓋和核的孔隙率為0.30-0.95，優選約0.60-0.85。所述蓋和核的孔隙率可以為相同的或不同的。

在所述蓋和核中的孔隙率或孔密度差可以通過產生層析介質的條件的變化獲得，例如使用不同的量和百分數的珠材料、交聯劑、鹽和收縮劑。所述層析介質的孔隙率也可以通過在珠顆粒的不同層中選擇性加入將物理和化學降低孔隙率的不同的帶電或不帶電的化學實體來改性。