[發(fā)明專利]提高測(cè)序準(zhǔn)確性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580032046.4
• 申請(qǐng)日: 2015-06-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106795552B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R.里加蒂;J.M.鮑特爾
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 伊盧米納劍橋有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6844
• 分類號(hào): C12Q1/6844;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

本發(fā)明提供了提高測(cè)序準(zhǔn)確性的方法。例如，本發(fā)明的方法使用線性擴(kuò)增來(lái)產(chǎn)生模板分子的相對(duì)較小的群體，其隨后可以擴(kuò)增成DNA分子的較大的克隆群體以用于測(cè)序。

本發(fā)明提供了提高測(cè)序準(zhǔn)確性的方法。例如，本發(fā)明的方法使用線性擴(kuò)增從模板分子產(chǎn)生通常相對(duì)小的互補(bǔ)鏈群體，其中從特定模板產(chǎn)生的互補(bǔ)鏈彼此緊密接近保持，從而在分子與分子水平上校正錯(cuò)誤。可以隨后將線性擴(kuò)增的群體擴(kuò)增成較大的DNA分子的克隆群體，例如通過(guò)指數(shù)擴(kuò)增以進(jìn)行測(cè)序。

在克隆擴(kuò)增方案中的第一次延伸期間，可能將錯(cuò)誤引入DNA。圖1示出了第一延伸期間的誤摻入(misincorporation)錯(cuò)誤的示意圖100。在該實(shí)例中，首先將DNA分子與表面結(jié)合的寡核苷酸雜交。雜交的寡核苷酸然后在稱為“第一延伸”的步驟中通過(guò)DNA聚合酶延伸。在該實(shí)例中，聚合酶在第一延伸步驟期間在特定位置處摻入不正確的核苷酸(誤摻入的堿基顯示為交叉/星)。在第一次延伸后，進(jìn)行擴(kuò)增步驟，其產(chǎn)生在第一次延伸期間生成的DNA分子的多個(gè)拷貝。在擴(kuò)增期間，在第一延伸步驟期間引入的錯(cuò)誤在作為克隆群體的部分的所有分子中傳播(propagate)。誤摻入的堿基將被測(cè)序?yàn)椤案哔|(zhì)量錯(cuò)誤”，其可能難以與樣品中的真實(shí)突變區(qū)分開(kāi)。

在克隆擴(kuò)增過(guò)程的第一或第二循環(huán)中產(chǎn)生的摻入錯(cuò)誤在該特定位置被測(cè)序時(shí)產(chǎn)生混合信號(hào)。圖2示出了在第一擴(kuò)增循環(huán)期間的誤摻入錯(cuò)誤的示意圖200(誤摻入的堿基顯示為交叉/星)。在此早期階段時(shí)，克隆群體由兩種分子組成；一種分子具有正確的堿基，而另一種分子攜帶誤摻入的堿基。隨著克隆擴(kuò)增過(guò)程繼續(xù)，這兩個(gè)分子用作模板以產(chǎn)生更多的DNA分子。最終的克隆群體可以由大約相等量的野生型和誤摻入的分子兩者組成，盡管隨機(jī)事件可能使比率偏斜。由分子的混合群體產(chǎn)生的混合信號(hào)產(chǎn)生“低質(zhì)量”堿基識(shí)別(basecall)。誤摻入事件發(fā)生的時(shí)機(jī)(timing)(循環(huán)數(shù))，連同在擴(kuò)增的早期循環(huán)中發(fā)生的隨機(jī)效應(yīng)，將影響存在于特定克隆群體中的野生型和突變體分子的比例。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可用于實(shí)質(zhì)性減少或消除在第一延伸期間可能產(chǎn)生的高質(zhì)量錯(cuò)誤。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法還可以用于減少由在擴(kuò)增的前幾個(gè)循環(huán)期間核苷酸的誤摻入引起的錯(cuò)誤。

根據(jù)本發(fā)明，提供了具有改善的準(zhǔn)確性的測(cè)序方法，所述方法包括：

提供核酸模板；

通過(guò)線性擴(kuò)增直接從所述模板核酸產(chǎn)生包含彼此緊密接近保持(retained inclose proximity to each other)或可鑒定為從相同模板核酸獲得的多個(gè)互補(bǔ)寡核苷酸鏈的群體；并且

對(duì)所述接近保持(said proximity retained)(例如表面結(jié)合)的寡核苷酸實(shí)施測(cè)序反應(yīng)。

優(yōu)選地，存在有至少三輪的線性擴(kuò)增。

通過(guò)具有最小數(shù)量的三輪線性擴(kuò)增，與典型的指數(shù)擴(kuò)增方法相比，任何引入的錯(cuò)誤的影響將被稀釋。例如，如果我們假設(shè)從表面上的ssDNA鏈A開(kāi)始，那么線性擴(kuò)增僅在每輪中產(chǎn)生拷貝A’，而指數(shù)擴(kuò)增在第一輪中產(chǎn)生A’，但然后在隨后的輪次中A和A’兩者，那么在第一輪產(chǎn)生A’中產(chǎn)生的錯(cuò)誤將導(dǎo)致A’鏈在第1輪的100％錯(cuò)誤(對(duì)于兩種擴(kuò)增)，在第2輪的50％錯(cuò)誤(對(duì)于兩種擴(kuò)增)，但是然后在第3輪時(shí)，只有1/3的A’鏈在線性擴(kuò)增中具有錯(cuò)誤，但對(duì)于指數(shù)擴(kuò)增，2/4的A’鏈具有錯(cuò)誤。在這之后，使用指數(shù)擴(kuò)增繼續(xù)產(chǎn)生具有錯(cuò)誤的A’鏈的50％，而使用本方法，使用核酸模板的線性擴(kuò)增，錯(cuò)誤變得更稀釋。

下面的實(shí)例顯示了用于線性擴(kuò)增和指數(shù)擴(kuò)增的錯(cuò)誤傳播的比較，其中A和A’表示制備的鏈，并且粗體和下劃線表示含有突變的鏈。

優(yōu)選地，該方法還包括在線性擴(kuò)增輪次之后且實(shí)施測(cè)序反應(yīng)之前實(shí)施互補(bǔ)鏈群體的進(jìn)一步(指數(shù))擴(kuò)增的步驟。