[發明專利]提高測序準確性的方法

有效

• 申請號: 201580032046.4
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN106795552B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: R.里加蒂;J.M.鮑特爾
• 申請（專利權）人: 伊盧米納劍橋有限公司
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

1.改善測序時的準確性的方法，所述方法包括：

提供核酸模板；

提供表面，所述表面具有與其結合的多個第一引物；

通過至少三輪線性擴增直接從所述模板核酸產生包含所述核酸模板的多個互補鏈的群體，其中所述互補鏈的群體彼此緊密接近保持或可鑒定為從相同模板核酸獲得，其中所述線性擴增包括：

i)將所述核酸模板與所述多個第一引物的引物雜交以產生雜交的第一引物；

ii)延伸所述雜交的第一引物以產生所述模板的互補鏈；

iii)變性以釋放與所述互補鏈緊密接近保持的所述核酸模板；并且

iv)重復雜交和擴增步驟以產生包含直接從所述模板核酸獲得的多個互補鏈的群體；

產生與所述表面結合的多個第二引物，其中所述產生在線性擴增后；

對所述互補鏈的群體進行指數擴增以產生擴增的寡核苷酸，其包括：

i)將所述互補鏈的群體與所述第二引物雜交以產生雜交的第二引物；

ii)延伸所述雜交的第二引物以產生延伸的第二引物；

iii)將所述延伸的第二引物與尚未延伸的所述第一引物雜交；

iv)延伸與所述延伸的第二引物雜交的所述第一引物，并且

v)重復雜交和延伸步驟以產生擴增的寡核苷酸；并且

對所述擴增的寡核苷酸進行測序反應。

2.如權利要求1的方法，其中提供多個核酸模板，并且產生多個互補鏈群體，其中每個群體直接從模板衍生，并且每個模板衍生的群體的成員保持彼此緊密接近。

3.如權利要求1或2的方法，其中所述互補鏈群體的進一步指數擴增是橋式擴增。

4.如前述權利要求中任一項的方法，其中所述表面是固體支持物。

5.如前述權利要求中任一項的方法，其中所述表面是平面元件(planar element)。

6.如權利要求4的方法，其中所述固體支持物是流動池或珠。

7.如前述權利要求中任一項的方法，其中在線性擴增之前環化所述核酸模板。

8.如權利要求7的方法，其中環化使用環連接酶(circligase)。

9.如權利要求7或8中任一項的方法，其中所述環化的模板核酸的雜交和延伸產生多聯體。

10.如權利要求9的方法，其中然后將所述多聯體結合到所述表面，任選地通過與反向第一引物雜交。

11.如前述權利要求中任一項的方法，其中所述表面包含多個第二引物/擴增引物或其片段。

12.如權利要求10或11的方法，其中所述表面是固體支持物。

13.如權利要求12的方法，其中所述方法包括將反向互補寡核苷酸與第二引物片段雜交的步驟，其中所述反向互補寡核苷酸在其5’端包含作為全長第二引物序列的一部分的額外堿基。

14.如權利要求12-13中任一項的方法，其中將所述第二引物或其片段接枝到附著點上。

15.如權利要求14的方法，其中通過鏈霉抗生物素蛋白/生物素連接進行接枝。

16.如權利要求14的方法，其中通過硫代磷酸酯或點擊化學接枝。

17.如權利要求14至16中任一項的方法，其中所述固體支持物上的約一半的附著點由第一引物占據。

18.如權利要求17的方法，其中隨后將第二引物接枝到剩余的可用接枝附著點上。