[發明專利]定量肽或蛋白質分析

有效

• 申請號: 201580030382.5
• 申請日: 2015-06-09
• 公開（公告）號: CN106662591B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: J.P.哈尼;C.L.埃蒂內;S.侯;E.拉加;R.賈納帕蒂
• 申請（專利權）人: 皮爾斯生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N23/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 周蓉;黃希貴

本發明根據基于浴銅靈的組合物復合物，如浴銅靈二磺酸二鈉鹽水合物復合物，提供尤其適用于質譜分析的肽和/或蛋白質定量方法、套組和組合物。所述方法是使用較小樣品體積的單步快速吸光度方法。其產生具有高信背比的穩固信號并且精確定量具有低可變性和高靈敏度的甚至復雜的肽混合物。

相關申請的交叉參考

本申請要求2014年6月11日申請的美國臨時專利申請第62/010,594號的優先權，其全部內容以引用的方式并入本文中。

技術領域

適用于在分析之前通過質譜分析(MS)和其它類型的分析測定小體積樣品的濃度的肽和/或蛋白質分析方法、組合物以及套組。

背景技術

質譜分析(MS)是用于在多個樣品之間進行數千種蛋白質的同時鑒別和相對定量的靈敏方法。MS儀器的持續進展不斷推動科學界能夠在極大程度上表征復雜的生物學 系統中的蛋白質動力學。盡管MS功能，在無顯著預注入特征化或標準化的情況下分析 大多數MS樣品，因為當前監測和測量蛋白質的方法，如UV吸收或二喹啉甲酸(BCA) 分析在無肽的情況下效果較差，消耗過多的有價值的樣品，并且不具有所需靈敏度。此 樣品特征化和標準化缺乏導致MS實驗標準化和再現性的困難和顯著的低生產率儀器時 間。

可商購的比色蛋白質和肽溶液定量方法包括縮二脲(Gornall等人《生物化學雜志(J. Biol.Chem.)》177(1949)751)、Lowry(Lowry等人《生物化學雜志》193(1951)265、 二喹啉甲酸(BCA)(Smith等人《分析生物化學(Anal.Biochem.)》150(1985)76)、考 馬斯藍G-250染料結合(Bradford,《分析生物化學》72(1976)248)以及膠態金(Stoscheck, 《分析生物化學》160(1987)301)。

縮二脲方法是基于形成與銅離子的復合物的蛋白質。肽氮在堿性條件下與銅(II)離子結合，產生紫色顏色。產物的吸收最大值是550nm。靈敏度是1mg蛋白質/ml到6 mg蛋白質/ml?？s二脲方法是相比于比色蛋白質測定的其它商購方法相對不靈敏的蛋白 質測定方法。

另一方法組合縮二脲反應和銅(1)-浴銅靈螯合反應(通過與銅-浴銅靈螯合反應組 合的逆縮二脲方法測定蛋白質?！杜R床化學學報(Clinica Chimica Acta.)》,216(1993)103-111)。在此方法中，樣品蛋白質在第一步驟期間形成Cu²⁺-蛋白質螯合復合物(縮二 脲反應)。通過抗壞血酸將過量Cu²⁺還原成Cu⁺，使得Cu⁺在第二步驟期間形成Cu⁺-浴銅 靈螯合復合物。所形成的Cu⁺-浴銅靈螯合復合物的量與蛋白質濃度成反比。此為使用浴 銅靈螯合劑測定蛋白質濃度的陰性或間接分析。

勞里法(Lowry method)是經修改的縮二脲反應。其在兩個步驟中進行：首先，肽鍵在堿性條件下與銅(II)離子反應，接著通過芳香族氨基酸的銅催化氧化使福林-喬卡 梯奧磷鉬酸-磷鎢酸還原成雜多鉬藍。產物的吸收最大值是750nm。勞里法比縮二脲方 法更靈敏，對于牛血清白蛋白(BSA)，線性靈敏度為0.1mg蛋白質/ml到1.5mg蛋白 質/ml。某些氨基酸、清潔劑、脂質、糖和核酸干擾反應。反應是pH依賴性的并且pH 應保持在pH 10與pH 10.5之間。

BCA方法與勞里法有關，因為蛋白質中的肽鍵首先還原銅離子(Cu²⁺)以在堿性介質中產生四齒亞銅離子(Cu¹⁺)復合物。接著使亞銅離子復合物與BCA(每個Cu¹⁺2個 分子BCA)反應以形成可以在562nm處測量到的深紫色。下文顯示BCA-銅反應：