[發(fā)明專(zhuān)利]自身癌抗原特異性CD8+ T細(xì)胞的分離及增殖方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201580001522.6
• 申請(qǐng)日: 2015-03-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105473731B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 權(quán)炳世;姜鉉貴;金光揮;金榮雨;金永昊;樸丙圭;樸相潤(rùn);樸商在;嚴(yán)炫皙;吳好植;劉憲;李敦吉;李承勛;李映宙;李振洙;崔范奎
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 國(guó)立癌Center
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/24
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/24;C12N5/0783
• 代理公司: 北京派特恩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11270
• 代理人: 景鵬;姚開(kāi)麗

1.一種自身癌抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞的分離和大量培養(yǎng)的方法，其特征在于，包括：

步驟a)，篩選存在于癌癥患者血液內(nèi)的自身癌抗原的CD8⁺T細(xì)胞表位，其中所述自身癌抗原選自由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3組成的組中；

步驟b)，與上述表位的肽及白細(xì)胞介素-2一同，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)從癌癥患者的血液中分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞；

步驟c)，在培養(yǎng)的上述外周血單個(gè)核細(xì)胞中添加與步驟b)相同的肽來(lái)誘導(dǎo)4-1BB表達(dá)；

步驟d)，在涂敷有抗-4-1BB抗體的培養(yǎng)板中孵育誘導(dǎo)了4-1BB表達(dá)的細(xì)胞之后，去除未附著的細(xì)胞；

步驟e)，將在步驟d)中分離的自身癌抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞和經(jīng)照射的同種異體的外周血單個(gè)核細(xì)胞，懸浮在含白細(xì)胞介素-2、抗-CD3的抗體和自體血漿的培養(yǎng)基中；以及

步驟f)，通過(guò)追加注入培養(yǎng)基，大量培養(yǎng)步驟e)中的自身癌抗原特異性CD8⁺T細(xì)胞，

其中，步驟a)的篩選表位包括：

a-1)，在由人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶、WT1、NY-ESO1及黑素瘤抗原-A3組成的組中，篩選步驟a)的患者的適當(dāng)?shù)淖陨戆┛乖?lèi)型；

a-2)，收集步驟a)的患者的HLA-A型或狀態(tài)的數(shù)據(jù)；

a-3)，使用來(lái)自步驟a-1)和步驟a-2)的信息，通過(guò)算法選擇適當(dāng)?shù)腃D8⁺T細(xì)胞表位；

a-4)，合成在步驟a-3)中的各表位的肽；

a-5)，在含步驟a-4)中的各肽和IL-2的CTL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞；

a-6)，通過(guò)添加與步驟a-4)中相同的肽，誘導(dǎo)所培養(yǎng)的細(xì)胞中的4-1BB的表達(dá)；

a-7)，使用流式細(xì)胞儀，分析在步驟a-6)中收集的細(xì)胞上的4-1BB⁺和CD8⁺的比率；及

a-8)，選擇誘導(dǎo)高4-1BB表達(dá)的一種或多種肽作為步驟a)中的患者的CD8⁺T細(xì)胞表位。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟a-8)中的選擇表位是使用評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行的，所述評(píng)分系統(tǒng)包括：

按照所收集的細(xì)胞中的4-1BB⁺和CD8⁺的表達(dá)比率來(lái)確定得分，其中，0-3％的得分被確定為1，4-10％的得分被確定為2，11-15％的得分被確定為3，16-20％的得分被確定為4，20％以上的得分被確定為5。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在上述步驟b)中，表位是由選自由序列1至序列15組成的組中的氨基酸序列形成的肽。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟b)中，培養(yǎng)基為包含自體血漿的培養(yǎng)基。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟b)中，培養(yǎng)進(jìn)行12至16天。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟c)中，表達(dá)誘導(dǎo)通過(guò)培養(yǎng)進(jìn)行12至36小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，上述步驟d)中，培養(yǎng)進(jìn)行1至20分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟e)中的外周血單個(gè)核細(xì)胞分離自正常供體。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟f)中的大量培養(yǎng)執(zhí)行4至15天。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在執(zhí)行步驟f)中的大量培養(yǎng)期間，在培養(yǎng)第4天、第7天、第9天、第11天及第14天追加注入培養(yǎng)基。