[發明專利]CRISPR-Cas9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異性靶向CMAH基因的sgRNA

有效

• 申請號: 201580000479.1
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN105518135B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 蔡志明;牟麗莎;謝崇偉;高漢超;劉璐;陳鵬飛;張軍方;陸贏
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/867
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭愿潔

本發明公開了一種運用CRISPR?Cas9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異性靶向CMAH基因的sgRNA。本發明的特異性靶向CMAH基因的sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’?N(20)NGG?3’的序列排列規則，其中N(20)表示20個連續的堿基，其中每個N表示A或T或C或G；在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5個外顯子編碼區或與相鄰內含子的交界處；在CMAH基因上的靶序列是唯一的。本發明的sgRNA用于CRISPR?Cas9特異性敲除豬CMAH基因的方法中，能夠快速、精確、高效、特異性地敲除豬CMAH基因，有效地解決構建CMAH基因敲除豬周期長和成本高的問題。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及基因敲除技術領域，具體涉及CRISPR-Cas9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異性靶向CMAH基因的sgRNA。

背景技術

器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬的患者通過器官移植而延續生命。隨著人口老齡化及醫療技術的進步，需要進行器官移植手術的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴重制約了器官移植手術的開展。以腎臟移植為例，我國每年需要進行腎移植的患者多達30萬，而可用于移植的捐獻腎臟不超過1萬例，大部分患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其他物種，以提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。

目前，根據生物安全性、生理功能指標、經濟性及稀有物種保護等多方面評價，豬成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到人會產生強烈的免疫排斥反應。因此，通過基因工程對豬進行改造，以產生適合于人體移植的器官，成為異種移植的終極目標。

免疫學的研究發現豬的細胞表面表達一種糖類化合物：N-羥乙酰神經氨酸(N-Glycolylneuraminic Acid，Neu5Gc)。它的合成依賴于胞苷單磷酸-N-乙酰神經氨酸羥化酶(cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)。人類細胞由于缺乏有功能的CMAH基因，不能合成Neu5Gc。而豬細胞表面的Neu5Gc進入人體后可被人體免疫系統識別并引發免疫排斥反應。因此，需要消除豬細胞表面的Neu5Gc分子以減少異種供體器官的免疫原性。而準確高效的敲除豬CMAH基因，是消除Neu5Gc引起的免疫排斥的關鍵步驟。

目前，常見的基因敲除技術包括同源重組(Homologus Recombination，HR)技術、類轉錄激活效應子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)技術、鋅指核酸酶(Zinc-Finger Nuclease，ZFN)技術以及最近發展的規律成簇間隔短回文重復(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，CRISPR)技術。HR技術由于重組效率低下(效率大約只有10^-6)，對突變體的篩選工作非常耗時和低效，已逐漸被取代。TALEN技術和ZFN技術的切割效率一般能達到20％，但都需要構建可以識別特定序列的蛋白質模塊，前期工作繁瑣費時。ZFN技術的模塊設計較為復雜且有較高的脫靶率，其應用有限。

CRISPR是一種源于原核生物的后天免疫系統，該系統執行干擾功能的復合物由蛋白質Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統已發現有三種類型，其中第二類Cas9系統組成簡單，已被積極應用于基因工程領域。Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA——crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)與靶序列互補識別的原理實現的?，F在已經將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(single guide RNA)，能夠識別特定的基因序列，引導Cas9蛋白進行切割。在真核生物中，DNA被切斷后發生非同源重組末端連接，造成移碼突變，最終導致基因功能性敲除。