[發(fā)明專利]CRISPR-Cas9特異性敲除豬CMAH基因的方法及用于特異性靶向CMAH基因的sgRNA

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580000479.1
• 申請日: 2015-06-12
• 公開（公告）號: CN105518135B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發(fā)明（設計）人: 蔡志明;牟麗莎;謝崇偉;高漢超;劉璐;陳鵬飛;張軍方;陸贏
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/867
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭愿潔

1.在運用CRISPR-Cas9特異性敲除豬CMAH基因中用于特異性靶向CMAH基因的sgRNA，其特征在于：

(1)所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列規(guī)則，其中N(20)表示20個連續(xù)的堿基，其中每個N表示A或T或C或G，符合所述規(guī)則的靶序列位于正義鏈或反義鏈；

(2)所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列位于CMAH基因的N端的5個外顯子編碼區(qū)，或靶序列的一部分位于CMAH基因的N端的5個外顯子，其余部分跨越與相鄰內(nèi)含子的交界，位于相鄰內(nèi)含子；

(3)所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列是唯一的；

所述靶序列為序列表中SEQ ID NO：2或4所示的序列。

2.sgRNA或其在CMAH基因上的靶序列在制備運用CRISPR-Cas9特異性敲除豬CMAH基因的試劑盒中的用途，其特征在于，所述sgRNA在CMAH基因上的靶序列為SEQ ID NO：2或4所示的序列，所述用途包括如下步驟：

(1)在權利要求1所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在權利要求1所述的sgRNA的靶序列對應的互補序列的兩端加上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；將合成的所述正向寡核苷酸序列與反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核苷酸；

(2)將所述雙鏈寡聚核苷酸連入線性化的攜帶Cas9基因的表達載體，得到攜帶含相應靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表達載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆，并對所述陽性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；

(3)用所述攜帶有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表達載體、包裝質(zhì)粒和包裝細胞系包裝出同時攜帶靶向CMAH基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

(4)使用所述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養(yǎng)；然后收集被感染的目的細胞，以其基因組DNA為模板擴增包含所述靶序列的基因片段，經(jīng)過變性、復性及酶切，確定CMAH基因的敲除情況。

3.根據(jù)權利要求2所述的用途，其特征在于，所述表達載體為序列表中SEQ ID NO：62所示序列的載體。

4.根據(jù)權利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述用途 包括如下步驟：

(1)在權利要求1所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列，合成得到正向寡核苷酸序列；在權利要求1所述的sgRNA的靶序列對應的互補序列的5’-端加上AAAC序列、3’-端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；將合成的所述正向寡核苷酸序列與反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核苷酸；

(2)將所述雙鏈寡聚核苷酸連入如序列表中SEQ ID NO：62所示序列的表達載體lentiCRISPR v2經(jīng)BsmB I限制性內(nèi)切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶sgRNA寡聚核苷酸的重組表達載體lentiCRISPR v2-CMAH，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆，并對所述陽性克隆搖菌、提取質(zhì)粒；

(3)用所述表達載體lentiCRISPR v2-CMAH、包裝質(zhì)粒和包裝細胞系包裝出同時攜帶靶向CMAH基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

(4)使用所述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養(yǎng)；然后收集被感染的目的細胞，以其基因組DNA為模板擴增包含所述靶序列的基因片段，經(jīng)過變性、復性及酶切，確定CMAH基因的敲除情況。

5.根據(jù)權利要求4所述的用途，其特征在于，所述包裝質(zhì)粒為質(zhì)粒pLP1、質(zhì)粒pLP2和質(zhì)粒pLP/VSVG；所述包裝細胞系為HEK293T細胞。