[發明專利]CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法及用于特異性靶向vWF基因的sgRNA

在審

• 申請號: 201580000477.2
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN105518140A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 蔡志明;牟麗莎;高漢超;謝崇偉;劉璐;陳鵬飛;張軍方;陸贏
• 申請（專利權）人: 深圳市第二人民醫院
• 主分類號: C12N15/117
• 分類號: C12N15/117;C12N15/867
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭愿潔

1.在CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因中用于特異性靶向vWF基因的sgRNA，其特征在 于：

（1）所述sgRNA在vWF基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列規則，其中N(20) 表示20個連續的堿基，其中每個N表示A或T或C或G，符合規則的靶序列可以位于正義鏈或反 義鏈；

（2）所述sgRNA在vWF基因上的靶序列位于vWF基因的外顯子編碼區；

（3）所述sgRNA在vWF基因上的靶序列是唯一的。

2.根據權利要求1所述的用于特異性靶向vWF基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序列 為序列表中SEQIDNO：1~58中任一條序列所示的序列。

3.根據權利要求1所述的用于特異性靶向vWF基因的sgRNA，其特征在于，所述靶序列 為序列表中SEQIDNO：1所示的序列。

4.CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

（1）在權利要求1-3任一項所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序 列，合成得到正向寡核苷酸序列；在權利要求1-3任一項所述的sgRNA的靶序列對應的互補 序列的兩端加上合適的用于形成粘性末端的序列，合成得到反向寡核苷酸序列；將合成的 所述正向寡核苷酸序列與反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核 苷酸；

（2）將所述雙鏈寡聚核苷酸連入線性化的攜帶Cas9基因的表達載體，得到攜帶含相應 靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表達載體，轉化感受態細菌，篩選鑒定出正確的陽 性克隆，并對所述陽性克隆搖菌、提取質粒；

（3）用所述攜帶有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表達載體、包裝質粒和包裝細胞系包 裝出同時攜帶靶向vWF基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

（4）使用所述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養；然后收集被感染的目的細胞， 以其基因組DNA為模板擴增包含所述靶序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確定vWF基 因的敲除情況。

5.根據權利要求4所述的CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法，其特征在于，所 述表達載體為序列表中SEQIDNO：59所示序列的載體。

6.根據權利要求4或5所述的CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法，其特征在于， 所述方法包括如下步驟：

（1）在權利要求1-3任一項所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列，合成得到正 向寡核苷酸序列；在權利要求1-3任一項所述的sgRNA的靶序列對應的互補序列的5’-端加 上AAAC序列、3’-端加上C，合成得到反向寡核苷酸序列；將合成的所述正向寡核苷酸序列與 反向寡核苷酸序列退火、復性，形成具有粘性末端的雙鏈寡聚核苷酸；

（2）將所述雙鏈寡聚核苷酸連入如序列表中SEQIDNO：59所示序列的表達載體 lentiCRISPRv2經BsmBI限制性內切酶酶切得到的線性化載體，得到攜帶sgRNA寡聚核苷 酸的重組表達載體lentiCRISPRv2-vWF，轉化感受態細菌，篩選鑒定出正確的陽性克隆，并 對所述陽性克隆搖菌、提取質粒；

（3）用所述表達載體lentiCRISPRv2-vWF、包裝質粒和包裝細胞系包裝出同時攜帶靶 向vWF基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒；

（4）使用所述假型慢病毒感染目的細胞，并進一步培養；然后收集被感染的目的細胞， 以其基因組DNA為模板擴增包含所述靶序列的基因片段，經過變性、復性及酶切，確定vWF基 因的敲除情況。

7.根據權利要求6所述的CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法，其特征在于，所述 包裝質粒為質粒pLP1、質粒pLP2和質粒pLP/VSVG；所述包裝細胞系為HEK293T細胞。