[發(fā)明專利]CRISPR-Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法及用于特異性靶向vWF基因的sgRNA

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201580000477.2
• 申請日: 2015-06-11
• 公開（公告）號: CN105518140A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡志明;牟麗莎;高漢超;謝崇偉;劉璐;陳鵬飛;張軍方;陸贏
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/117
• 分類號: C12N15/117;C12N15/867
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭愿潔

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及基因敲除技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及CRISPR- Cas9特異性敲除豬vWF基因的方法及用于特異性靶向vWF基因的sgRNA。

背景技術(shù)

器官移植是治療器官衰竭疾病最有效的治療手段。迄今為止，全球已有近百萬的 患者通過器官移植而延續(xù)生命。隨著人口老齡化及醫(yī)療技術(shù)的進步，需要進行器官移植手 術(shù)的病人越來越多，但供體器官的短缺嚴(yán)重制約了器官移植手術(shù)的開展。以腎臟移植為例， 我國每年需要進行腎移植的患者多達30萬，而可用于移植的捐獻腎臟不超過1萬例，大部分 患者死于腎衰竭。依靠死后器官捐獻已不能滿足器官移植的需要。通過基因工程改造其他 物種，以提供合適于人體移植的器官，成為解決人類供體器官短缺問題的主要途徑。

目前，根據(jù)生物安全性、生理功能指標(biāo)、經(jīng)濟性及稀有物種保護等多方面評價，豬 成為了最為理想的異種器官來源。但豬和人之間存在巨大的差異，直接將豬的器官移植到 人會產(chǎn)生強烈的免疫排斥反應(yīng)。因此，通過基因工程對豬進行改造，以產(chǎn)生適合于人體移植 的器官，成為異種移植的終極目標(biāo)。

在進行豬肺向靈長類動物狒狒移植的過程中發(fā)現(xiàn)豬源的肺在移植后釋放大量的 vWF(vonWillebrandfactor)，而人及其他靈長類動物體內(nèi)的異種反應(yīng)性抗體能結(jié)合vWF 的Alpha(1,3)Gal抗原決定簇并能激活靈長類的血小板。vWF是一類具有大分子量、有黏附 功能的糖蛋白，它能介導(dǎo)血小板的粘連從而促進傷口的止血，而vWF的缺陷將導(dǎo)致粘膜及皮 膚的出血癥。vWF介導(dǎo)的蛋白-蛋白相互作用在止血過程及血栓的形成中發(fā)揮重要的調(diào)控作 用。在豬肺向狒狒移植的研究中表明，大量的異種反應(yīng)性抗體能結(jié)合豬肺釋放的vWF從而與 豬肺血管的內(nèi)皮細胞脫離。異種反應(yīng)性抗體/vWF復(fù)合體能通過識別血小板表面的Gplb受體 激活并聚集人及其他靈長類動物的血小板，從而導(dǎo)致急性的肺移植物失能。

在豬肺的exvivo人血灌注實驗中，使用血小板GPIIb-IIIa受體拮抗劑或血小板 受體GPIb/vWF相互作用抑制劑能顯著性提高移植物的存活時間。而使用vWF缺陷的豬肺也 能有效地減輕豬-狒狒異種移植過程中常見的凝血病。此外，使用vWF缺陷的豬肺進行異種 移植還能顯著性降低內(nèi)皮細胞的激活。因而，通過基因工程技術(shù)敲除豬的vWF，有望在使用 缺陷vWF豬源器官進行異種移植時減輕異種移植器官失能的痹癥，將對異種移植作出重要 貢獻。實現(xiàn)此策略最好的途徑就是構(gòu)建vWF分子缺失的基因修飾豬。

目前，常見的基因敲除技術(shù)包括同源重組(HomologusRecombination，HR)技術(shù)、 類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)子核酸酶(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease，TALEN) 技術(shù)、鋅指核酸酶(Zinc-FingerNuclease，ZFN)技術(shù)以及最近發(fā)展的規(guī)律成簇間隔短回文 重復(fù)(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeat，CRISPR)技術(shù)。HR 技術(shù)由于重組效率低下(效率大約只有10^-6)，對突變體的篩選工作非常耗時和低效，已逐漸 被取代。TALEN技術(shù)和ZFN技術(shù)的切割效率一般能達到20％，但都需要構(gòu)建可以識別特定序 列的蛋白質(zhì)模塊，前期工作繁瑣費時。ZFN技術(shù)的模塊設(shè)計較為復(fù)雜且有較高的脫靶率，其 應(yīng)用有限。

CRISPR是一種源于原核生物的后天免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)執(zhí)行干擾功能的復(fù)合物由蛋 白質(zhì)Cas和CRISPR-RNA(crRNA)組成。目前該系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)有三種類型，其中第二類Cas9系統(tǒng) 組成簡單，已被積極應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域。Cas9靶向切割DNA是通過兩種小RNA——crRNA (CRISPRRNA)和tracrRNA(trans-activatingcrRNA)與靶序列互補識別的原理實現(xiàn)的。現(xiàn) 在已經(jīng)將兩種小RNA融合成一條RNA鏈，簡稱sgRNA(singleguideRNA)，能夠識別特定的基 因序列，引導(dǎo)Cas9蛋白進行切割。在真核生物中，DNA被切斷后發(fā)生非同源重組末端連接，造 成移碼突變，最終導(dǎo)致基因功能性敲除。