[發明專利]AML1基因和ETO基因檢測探針及其制備方法和試劑盒

在審

• 申請號: 201511029404.4
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN105483253A
• 公開（公告）日: 2016-04-13
• 發明（設計）人: 陳紹宇;何瑰;張會清
• 申請（專利權）人: 廣州安必平醫藥科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

技術領域

本發明屬于生物技術，特別是涉及AML1基因和ETO基因檢測探針及其制 備方法和試劑盒。

背景技術

急性髓系白血病t(8；21)(q22；q22)(AML1/ETO)是一種通常表現為中性粒細 胞伴有成熟分化的AML，是AML最常見的染色體結構異常之一，占AML的 5％～12％；占核型異常伴成熟之AML的1/3。約有8％成人和12％兒童急性髓 系白血病患者可見該融合基因，其中以AMLM2型(50％)和AMLM2b(90％) 型多見。t(8；21)(q22；q22)易位影響AML1基因(又稱RUNX1)，此基因編碼CBFa 及ETO基因。基因轉錄物在AML伴t(8；21)患者中可檢測到。AML1基因的斷 裂發生于單個內含子內部。

AML1/ETO融合被認為是一種預后良好的細胞和分子遺傳學異常，伴有 t(8；21)的AML通常化療反應好，緩解率高，鞏固期使用大劑量阿糖胞苷(HD Ara-C)無病生存期長。但若伴有其他分子學異常，如一條性染色體缺失及 del(9)(q22)、KIT、FLT3、AML1-ETO9a剪接變體等更易致白血病生成，且影響 預后。AML1-ETO能抑制GATA-1乙酰化，從而抑制紅系分化，AML1/ETO對 其靶基因的影響以及冬凌草、格列衛靶向治療已成為目前研究的熱點。

細胞遺傳學分析(核型分析)是最常使用的檢測t(8；21)的方法。但對于 隱匿易位或復雜易位形式，易造成漏檢。PCR方法只能檢測很小范圍內的基因 序列，所以當基因序列發生變異時，易出現假陰性結果。FISH檢測方法可用于 外周血或骨髓間期細胞中AML1/ETO融合基因檢測，具有敏感，特異，高效和 重復性好的特點，它能揭示了傳統的細胞遺傳學分析或由血液或骨髓形態學檢 查均未檢出亞微觀異常。因此，間期FISH可用于急性髓系白血病t(8；21)(q22；q 22)(AML1/ETO)診斷。目前，國外在AML1/ETO融合基因檢測方面取得很大 成就，而國內受各方面條件限制，檢測方法滯后，缺少相應的分子診斷試劑， 診斷試劑依賴進口，試劑價格高，檢測成本高，不易推廣。

熒光原位雜交(FluorescenceinsituhybridizationFISH)是20世紀80年 代末期在原有的放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性原位雜 交技術。目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、染色體精細結 構變異分析、病毒感染分析、人類產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組進化研究待 許多領域。FISH的基本原理是用已知的標記核酸為探針，按照堿基互補的原則， 與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。 由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與 染色體進行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統的放射性標記原位 雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染 色等特點，因此在分子細胞遺傳學領域受到普遍關注。

雜交所用的探針大致可以分類三類：1)染色體特異重復序列探針，例如α 衛星、衛星III類的探針，其雜交靶位常大于1Mb，不含散在重復序列，與靶位 結合緊密，雜交信號強，易于檢測；2)全染色體或染色體區域特異性探針，其 由一條染色體或染色體上某一區段上極端不同的核苷酸片段所組成，可由克隆 到噬菌體和質粒中的染色體特異大片段獲得；3)特異性位置探針，由一個或幾 個克隆序列組成。

探針的熒光素標記可以采用直接和間接標記的方法。間接標記是采用生物 素標記DNA探針，雜交之后用藕聯有熒光素親和素或者鏈霉親和素進行檢測， 同時還可以利用親和素-生物素-熒光素復合物，將熒光信號進行放大，從而可以 檢測500bp左右的片段。而直接標記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊 糖骨架共價結合，或在缺口平移法標記探針時將熒光素核苷三磷酸摻入。直接 標記法在檢測時步驟簡單，臨床使用方便。

而目前對于AML1/ETO基因FISH檢測，還缺少特異性高的檢測試劑盒。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種AML1基因和ETO基因檢測探針及其制備方 法，所制備的探針可用于檢測AML1基因和ETO基因狀態，即檢測AML1基因和 ETO基因檢測，實現細胞和染色體中直接觀察信號，具有很好的特異性。

實現上述目的的技術方案如下。