[發(fā)明專利]抑制心肌細(xì)胞程序性壞死的CaMKII的抑制劑及用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201511023013.1
• 申請(qǐng)日: 2015-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN105523969A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖瑞平;張巖;呂鳳祥;章婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號(hào): C07C311/29
• 分類號(hào): C07C311/29;A61K31/18;C12N7/00;C07K7/08;A61K35/761;A61K38/10;A61P9/00;A61P9/10;A61P9/04;A61P9/06
• 代理公司: 北京遞進(jìn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11414
• 代理人: 田豐

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于一種CaMKII的抑制劑及其在制備應(yīng)用于心臟損傷修復(fù)疾病的藥物中的用途。

背景技術(shù)

細(xì)胞死亡是涉及細(xì)胞發(fā)育、衰老和死亡的一個(gè)基本過程，分類為不同形式，包括細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬。以前的觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是一種嚴(yán)格控制、調(diào)控機(jī)制明確的主動(dòng)過程；而細(xì)胞壞死則被認(rèn)為是意外、被動(dòng)的細(xì)胞死亡。但最近的研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的細(xì)胞死亡因子可觸發(fā)“程序性”細(xì)胞壞死(即程序性壞死)，且細(xì)胞壞死有免疫源性，涉及重要的生理和病理過程，包括胚胎發(fā)育、細(xì)菌及病毒性感染的宿主反應(yīng)及組織損傷和炎癥。研究發(fā)現(xiàn)，受體相互作用蛋白1(RIP1)和3(RIP3)形成了壞死體，從而使混合系激酶區(qū)域樣蛋白(MLKL)磷酸化，最終導(dǎo)致了各類型細(xì)胞的程序性壞死。

成年心肌細(xì)胞是終末分化的細(xì)胞，心肌細(xì)胞的缺失是出現(xiàn)心力衰竭的一個(gè)重要致病因素。在過去的三十余年里，有大量研究關(guān)注心肌細(xì)胞凋亡而非細(xì)胞壞死，但細(xì)胞壞死早已被認(rèn)為是重度心肌損傷中細(xì)胞死亡的主要形式。普遍認(rèn)為，細(xì)胞壞死是一種不可調(diào)控的被動(dòng)細(xì)胞死亡形式，因此不可能成為用于治療的有用靶點(diǎn)。人們對(duì)心肌細(xì)胞壞死的根本機(jī)制依然知之甚少。

申請(qǐng)人在研究中發(fā)現(xiàn),RIP3上調(diào)在缺血性和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞壞死中發(fā)揮了重要作用，最終導(dǎo)致心肌重塑和心力衰竭。重要的是，申請(qǐng)人已經(jīng)證實(shí)，通過激活多功能Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II(CaMKII)而非之前報(bào)道的RIP1-RIP3-MLKL級(jí)聯(lián)反應(yīng)，上調(diào)RIP3可誘發(fā)心肌細(xì)胞壞死，揭示了一種全新模式的心肌細(xì)胞程序性壞死。另外，RIP3介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡同樣依賴于CaMKII，而非RIP1的激活。以RIP3-CaMKII通路為靶向可保護(hù)心臟，避免缺血性和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞程序性壞死、心肌重塑和心力衰竭。我們發(fā)現(xiàn)，CaMKII是RIP3的新底物和心肌細(xì)胞程序性壞死機(jī)制的組成成分，說明保護(hù)心肌細(xì)胞程序性壞死可以作為治療靶點(diǎn)。因此尋找合適阻斷CaMKII與RIP3通路的抑制劑成為了新的藥物開發(fā)難題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提出一種抑制心肌細(xì)胞程序性壞死的CaMKII的抑制劑，以及該CaMKII的抑制劑在制備抑制心肌細(xì)胞程序性壞死的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種抑制心肌細(xì)胞程序性壞死的CaMKII的抑制劑，該抑制劑為3-15μmol/kgKN-93、Ad-CaMKII-DN和/或3-15μmol/kg的AIP；所述的KN-93的結(jié)構(gòu)式為

所述的Ad-CaMKII-DN為CaMKII去活性突變腺病毒，是CaMKIIδC的丙氨酸替代43號(hào)賴氨酸殘基的突變體；所述的AIP的肽段序列為KKALRRQEAVDAL。

在試驗(yàn)中，結(jié)果顯示，本發(fā)明上述KN-93和AIP優(yōu)選為5-10μmol/kg。

上述的抑制劑，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖械狞c(diǎn)突變獲得的，該定點(diǎn)突變?cè)噭┖袨镼uikChangeII，Stratagene；該突變包括以下步驟：

1)將大鼠CaMKII-δC基因的編碼區(qū)克隆到pcDNA4/HisB質(zhì)粒上；然后用針對(duì)K43位點(diǎn)的引物，

上游引物：5'-ggacaagagtatgctgccgcaattatcaacaccaaaaag-3'，

下游引物：5'-ctttttggtgttgataattgcggcagcatactcttgtcc-3'，

以pcDNA4/HisB-CaMKIId2質(zhì)粒為模板，利用Hifi高保真酶進(jìn)行PCR，得到的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI于37℃處理6h，取10μl消化后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞里，再涂布于氨芐抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取單克隆培養(yǎng)并提質(zhì)粒測(cè)序，獲取K43A陽(yáng)性的克隆；

2)之后再將突變質(zhì)粒的基因編碼區(qū)以及標(biāo)簽一起克隆到腺病毒載體上，得到了Ad-CaMKIIδ-DN病毒。

本發(fā)明所述的抑制劑，其中所述的KN-93、AIP的濃度為3-15μmol/kg；優(yōu)選5-10μmol/kg；其中，應(yīng)用在細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)，所述的KN-93或AIP為濃度為5μmol/l；應(yīng)用在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，所述的KN-93或AIP為濃度為10μmol/kg；所述的Ad-CaMKII-DN為CaMKII去活性突變腺病毒，其用量為每個(gè)心肌細(xì)胞10-100個(gè)腺病毒。