[發明專利]抑制心肌細胞程序性壞死的CaMKII的抑制劑及用途

在審

• 申請號: 201511023013.1
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN105523969A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 肖瑞平;張巖;呂鳳祥;章婷
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07C311/29
• 分類號: C07C311/29;A61K31/18;C12N7/00;C07K7/08;A61K35/761;A61K38/10;A61P9/00;A61P9/10;A61P9/04;A61P9/06
• 代理公司: 北京遞進知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11414
• 代理人: 田豐

1.一種抑制心肌細胞程序性壞死的CaMKII的抑制劑，該抑制劑為3-15μmol/kgKN-93、 Ad-CaMKII-DN和/或3-15μmol/kg的AIP；所述的KN-93的結構式為

所述的Ad-CaMKII-DN為CaMKII去活性突變腺病毒，是CaMKIIδC的丙氨酸替代43號賴 氨酸殘基的突變體；所述的AIP的肽段序列為KKALRRQEAVDAL。

2.如權利要求1所述的抑制劑，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是采用定點突變試劑盒的 點突變獲得的，該定點突變試劑盒為QuikChangeII，Stratagene；該突變過程包括以下步驟：

1)將大鼠CaMKII-C基因的編碼區克隆到pcDNA4/HisB質粒上；然后用針對K43位點 的引物，

上游引物：5'-ggacaagagtatgctgccgcaattatcaacaccaaaaag-3'，

下游引物：5'-ctttttggtgttgataattgcggcagcatactcttgtcc-3'，

以pcDNA4/HisB-CaMKIId2質粒為模板，利用Hifi高保真酶進行PCR，得到的產物經限 制性內切酶DpnI于37℃處理6h，取10l消化后的產物轉化到Top10感受態細胞里，再涂 布于氨芐抗性的LB平板，37℃培養箱過夜培養，挑取單克隆培養并提質粒測序，獲取K43A陽 性的克隆；

2)之后再將突變質粒的基因編碼區以及標簽一起克隆到腺病毒載體上，得到了 Ad-CaMKII-DN病毒。

3.如權利要求1所述的抑制劑，其中，應用在細胞試驗時，所述的KN-93或AIP為濃度 為5μmol/l；應用在動物實驗時，所述的KN-93或AIP為濃度為10μmol/kg；所述的 Ad-CaMKII-DN為CaMKII去活性突變腺病毒，其用量為每個心肌細胞10-100個腺病毒。

4.一種CaMKII的抑制劑在制備抑制心肌細胞程序性壞死的藥物中的應用，所述CaMKII 的抑制劑包括KN-93、Ad-CaMKII-DN和AIP。

5.如權利要求4所述的應用，其中，所述的KN-93的分子式為C₂₆H₂₉C_lN₂O₄S，分子量501.04； 其結構式為

該KN-93濃度為3-15μmol/kgKN-93；所述的Ad-CaMKII-DN為CaMKII去活性突變腺病 毒；其用量為每個心肌細胞10-100個腺病毒；所述的AIP的肽段序列為KKALRRQEAVDAL，濃 度為3-15μmol/kg。

6.如權利要求4所述的應用，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是CaMKIIδC的丙氨酸替代 43號賴氨酸殘基的突變體。

7.如權利要求4所述的應用，其中，所述的Ad-CaMKII-DN是采用定點突變試劑盒的點 突變獲得的，包括以下步驟：

1)將大鼠CaMKII-C基因的編碼區克隆到pcDNA4/HisB質粒上；然后用針對K43位點 的引物，

上游引物：5'-ggacaagagtatgctgccgcaattatcaacaccaaaaag-3'，

下游引物：5'-ctttttggtgttgataattgcggcagcatactcttgtcc-3'，

以pcDNA4/HisB-CaMKIId2質粒為模板，利用Hifi高保真酶進行PCR，得到的產物經限 制性內切酶DpnI于37℃處理6h，取10l消化后的產物轉化到Top10感受態細胞里，再涂 布于氨芐抗性的LB平板，37℃培養箱過夜培養，挑取單克隆培養并提質粒測序，獲取K43A陽 性的克隆；

2)之后再將突變質粒的基因編碼區以及標簽一起克隆到腺病毒載體上，得到了 Ad-CaMKII-DN病毒。

8.如權利要求7所述的應用，其中，所述的Ad-CaMKII-DN所采用的定點突變試劑盒為 QuikChangeII，Stratagene。