[發明專利]一種造礁石珊瑚總RNA提取方法

在審

• 申請號: 201511018383.6
• 申請日: 2015-12-28
• 公開（公告）號: CN105420227A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 胡思敏;許昌有;黃暉;劉勝
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種造礁石珊瑚總RNA提取方法。

背景技術

珊瑚礁是地球上的生物多樣性最高生態系統之一，珊瑚礁生態系統不僅為人類的生產和生活提供各種生物資源，而且具有巨大的生態功能和生態價值，對保障生物多樣性、生物生產力和生態平衡具有重要作用。然而近年來，世界范圍內的珊瑚白化死亡現象日益頻繁，嚴重時導致珊瑚礁的退化。研究珊瑚白化機理不僅要了解珊瑚外在生理響應，更要深入認識引起這些變化的內在分子機制。造礁石珊瑚的種類繁多，有七十多屬。獲取高質量的造礁石珊瑚總RNA是進行分子機制研究的首要條件。RNA的質量好壞決定著可被反轉錄為cDNA的最大序列信息，特別是對于體內生活著大量微生物及蟲黃藻的復雜造礁石珊瑚共生體。要獲得大量完整、純度高的總RNA，首先要清除珊瑚體內的蟲黃藻、微生物等的影響，其次要對造礁石珊瑚組織進行充分完全地破碎，還要抑制RNA酶的降解作用，從而獲得高質量的總RNA。

目前常用的RNA提取方法多用于植物、動物組織的提取，并非適用于造礁石珊瑚，且這些方法通常存在RNA得率和純度較低的問題，難以進行下一步的分析。

目前，尚無造礁石珊瑚總RNA提取方法的專利及其他文獻資料。

發明內容

本發明的目的是為解決現有技術中沒有適用于造礁石珊瑚的RNA提取方法的問題，提供一種造礁石珊瑚總RNA提取方法；利用該方法提取的造礁石珊瑚RNA純度高、質量好，極大的減少了造礁石珊瑚RNA損耗和降低了DNA污染，能適用于后續RT-PCR等分子生物學實驗的要求。

本發明的造礁石珊瑚總RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和預處理、用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入異丙醇沉淀RNA，棄上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚總RNA，其特征在于，

所述的造礁石珊瑚的采集和預處理是用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA是將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解釋放出RNA；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分數為38％的水飽和酚(酸性水飽和酚，可以從試劑公司直接購買)、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸鈉和體積分數為5％的甘油，其余為無RNA酶的水(RNase-free水)。

所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其具體步驟為：

a、用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

b、將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解，振蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心5min，取上清液；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分數為38％的酸性水飽和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸鈉和體積分數為5％的甘油，其余為RNase-free水；

c、按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心15-20min；離心后溶液分3層，取出上層水相，按取出的水相與異丙醇的體積比為2:1的量加入異丙醇，室溫沉淀10min后12000g離心10min；棄上清，加入余下溶液等體積的無水乙醇，混勻，4℃、7500g離心5min；棄上清，干燥5-10min，得到造礁石珊瑚總RNA，將該RNA溶于RNase-freewater中-70～-80℃保存。

優選，所述的造礁石珊瑚為鹿角杯形珊瑚、叢生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黃濱珊瑚。

優選，所述的步驟a的無菌海水是經高溫滅菌且經0.22μ微孔濾膜過濾的海水。用無菌海水沖洗造礁石珊瑚體表，是為了去除珊瑚體表的其它附著的生物對造礁石珊瑚RNA提取的影響。

優選，所述的步驟b的造礁石珊瑚粉末與異硫氰酸胍裂解液用量比為3g:1ml；此比例下提取效果最佳，造礁石珊瑚過少會導致RNA濃度過低；造礁石珊瑚過多會導致裂解不完全，內源性酶降解RNA嚴重。

優選，所述的步驟b和c的振蕩混合為劇烈振蕩15s。

優選，還包括以下步驟：在步驟c的按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心15-20min后，再重復該操作2-3次；這樣處理后沉淀去除蛋白質的效果更好。