[發(fā)明專利]一種造礁石珊瑚總RNA提取方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201511018383.6
• 申請(qǐng)日: 2015-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN105420227A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡思敏;許昌有;黃暉;劉勝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院南海海洋研究所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種造礁石珊瑚總RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和預(yù)處理、用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入異丙醇沉淀RNA，棄上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚總RNA，其特征在于，

所述的造礁石珊瑚的采集和預(yù)處理是用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA是將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解釋放出RNA；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分?jǐn)?shù)為38％的酸性水飽和酚、0.8M硫

氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為5％的甘油，其余為無RNA酶的水。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，其具體步驟為：

a、用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

b、將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解，振蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心5min，取上清液；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分?jǐn)?shù)為38％的酸性水飽和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸鈉和體積分?jǐn)?shù)為5％的甘油，其余為RNase-free水；

c、按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心15-20min；離心后溶液分3層，取出上層水相，按取出的水相與異丙醇的體積比為2:1的量加入異丙醇，室溫沉淀10min后12000g離心10min；棄上清，加入余下溶液等體積的無水乙醇，混勻，4℃、7500g離心5min；棄上清，干燥5-10min，得到造礁石珊瑚總RNA，將該RNA溶于RNase-freewater中-70～-80℃保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的造礁石珊瑚為鹿角杯形珊瑚、叢生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黃濱珊瑚。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的步驟a的無菌海水是經(jīng)高溫滅菌且經(jīng)0.22μ微孔濾膜過濾的海水。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的步驟b的造礁石珊瑚粉末與異硫氰酸胍裂解液用量比為3g:1ml。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的步驟b和c的振蕩混合為劇烈振蕩15s。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，還包括以下步驟：在步驟c的按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心15-20min后，再重復(fù)該操作2-3次。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前在低于-80℃環(huán)境下超低溫保存。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前用干冰或液氮保存。