[發明專利]一種造礁石珊瑚總RNA提取方法

在審

• 申請號: 201511018383.6
• 申請日: 2015-12-28
• 公開（公告）號: CN105420227A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 胡思敏;許昌有;黃暉;劉勝
• 申請（專利權）人: 中國科學院南海海洋研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

1.一種造礁石珊瑚總RNA提取方法，包括造礁石珊瑚的采集和預處理、用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA、添加氯仿沉降再取水相，然后在水相中加入異丙醇沉淀RNA，棄上清，在余下溶液中加入乙醇沉淀RNA，得到造礁石珊瑚總RNA，其特征在于，

所述的造礁石珊瑚的采集和預處理是用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，然后在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

所述的用裂解液裂解造礁石珊瑚釋放出RNA是將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解釋放出RNA；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分數為38％的酸性水飽和酚、0.8M硫

氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸鈉和體積分數為5％的甘油，其余為無RNA酶的水。

2.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，其具體步驟為：

a、用無菌海水將造礁石珊瑚沖洗干凈并將其表面的水吸干，在液氮中磨成粉末，得到造礁石珊瑚粉末；

b、將造礁石珊瑚粉末用異硫氰酸胍裂解液裂解，振蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心5min，取上清液；所述的異硫氰酸胍裂解液含有體積分數為38％的酸性水飽和酚、0.8M硫氰酸胍、0.4M硫代氰酸氨、0.1M乙酸鈉和體積分數為5％的甘油，其余為RNase-free水；

c、按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心15-20min；離心后溶液分3層，取出上層水相，按取出的水相與異丙醇的體積比為2:1的量加入異丙醇，室溫沉淀10min后12000g離心10min；棄上清，加入余下溶液等體積的無水乙醇，混勻，4℃、7500g離心5min；棄上清，干燥5-10min，得到造礁石珊瑚總RNA，將該RNA溶于RNase-freewater中-70～-80℃保存。

3.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的造礁石珊瑚為鹿角杯形珊瑚、叢生盔形珊瑚、霜鹿角珊瑚或澄黃濱珊瑚。

4.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的步驟a的無菌海水是經高溫滅菌且經0.22μ微孔濾膜過濾的海水。

5.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的步驟b的造礁石珊瑚粉末與異硫氰酸胍裂解液用量比為3g:1ml。

6.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的步驟b和c的振蕩混合為劇烈振蕩15s。

7.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，還包括以下步驟：在步驟c的按步驟b的上清液與氯仿體積比為5:1的量在步驟b的上清液中加入氯仿，搖蕩混合，室溫放置5min，4℃、12000g離心15-20min后，再重復該操作2-3次。

8.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前在低于-80℃環境下超低溫保存。

9.根據權利要求1所述的造礁石珊瑚總RNA提取方法，其特征在于，所述的用于RNA提取的造礁石珊瑚使用前用干冰或液氮保存。