[發明專利]一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態性的引物及其方法

在審

• 申請號: 201511006951.0
• 申請日: 2015-12-30
• 公開（公告）號: CN105543347A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 梁耀銘;于世輝;趙薇薇;燕啟江;胡昌明;羅錦霞
• 申請（專利權）人: 廣州金域檢測科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態性的 引物及其方法。

背景技術

CYP2D6是第一個被確認由單基因控制的P450酶，CYP2D6是位于第22號染色體上， 其含有9個外顯子和8個內含子，總長為7kb左右，是一個完整的功能性基因。有研究發現， CYP2D6基因上游有2個高度同源的假基因，分別稱為CYP2D7P基因和CYP2D8P基因，CYP2D7P 基因與CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性，而且帶有TATA盒，但是由于在外顯子1的第226 位點上插入了一個胸腺嘧啶（T），從而改變了讀碼框架，使轉錄提前終止；CYP2D8P基因是一 個含有多個斷裂點的突變假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人體足跡中均不表達，只有 CYP2D6在肝、腸、腎和人腦中表達。

現代研究發現，肝臟中CYP2D6的含量僅占P450肝臟蛋白總量的2%，但是，它卻參與 代謝約25%的臨床用藥，包括抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥和鎮痛藥等。目前已發現 超過100種CYP2D6等位基因的變異，主要是單核苷酸變異、大片段基因的丟失以及多基因拷 貝，這些變異使CYP2D6基因呈現多態性，并決定其代謝表型的多樣性，使酶的活性表現為缺 失、降低、正?；蚴窃黾拥葞追N類型。

楊汐等人發表了一篇題目為“CYP2D6基因多態性與他莫昔芬治療”的論文，該論文 表明不同基因型的CYP2D6對他莫昔芬的代謝不同，產生的活性代謝產物(4-羥基他莫昔芬 和Endoxifen)濃度不同，其中PMs(含兩個無效等位基因致CYP2D6活性缺失)血漿中活性 代謝產物濃度最低，而UMs(含兩個以上正常功能等位基因，即多基因拷貝致CYP2D6活性增 強)血漿活性代謝產物濃度最高。因此，CYP2D6的多態性研究對臨床具有重要的意義，成為 目前研究的熱點。

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態性 的引物及其方法，該引物檢測CYP2D6基因C2850T(rs16947)位點，具有特異性好、靈敏度 高、準確性高等優點，為CYP2D6_C2850T基因多態性提供了一種簡單有效的檢測方法。

本發明提供了一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態性的引物，包括巢式PCR擴增引物 和SNaPshotPCR引物；所述巢式PCR擴增引物包括巢式A輪PCR擴增引物和巢式B輪PCR擴增 引物；所述巢式A輪擴增引物為：針對CYP2D6的上游引物5’-CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3’ （SEQIDNO.1）和下游引物5’-CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3’（SEQIDNO.2）；所述巢式B輪 PCR擴增引物為：針對CYP2D6_C2850T的上游引物5’-GCTCACGCTGCACATCCGGA-3’（SEQID NO.3）和下游引物5’-GGGCAAGGGTGGTGGGTTGA-3’（SEQIDNO.4）；所述SNaPshotPCR引物 為：針對CYP2D6_C2850T的SNaPshotPCR引物5’-TTTTTTTTTTTTTTCAGGTCAGCCACCACTATGC- 3’（SEQIDNO.5）。

另外，本發明還提供了一種檢測CYP2D6_C2850T基因多態性的方法，包括如下步 驟：

S1提取DNA樣品；

S2采用權利要求1所述的巢式A輪PCR擴增引物進行PCR擴增，對巢式A輪PCR擴增產物進 行純化；

S3以巢式A輪PCR擴增產物為模板采用權利要求1所述的巢式B輪PCR擴增引物進行多重 PCR擴增；

S4采用權利要求1所述的SNaPshotPCR引物進行SNaPshotPCR擴增，對擴增產物進行 純化；

S5毛細管電泳技術進行檢測，對檢測結果進行分析，確定SNP位點及其基因型。

進一步地，所述步驟S1中的DNA樣品為EDTA抗凝外周血的DNA樣品。

進一步地，所述步驟S2中的巢式A輪PCR擴增反應條件包括：階段1：98℃3min；階 段2：98℃10s；階段3：72℃3min；階段4：返回到階段2，24個循環；階段5：72℃5min；階段 6：25℃保溫。